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Resumen primer parcial: ingeniería genética

Enzimas Klenow: o fragmento de Klenow contiene las actividades 5′→3′ polimerasa y 3′→5′ exonucleasa. Desoxinucleotidil transferasa terminal: es una ADN polimerasa que cataliza la adición de una cola de homopolímero a los extremos 3′ -OH del ADN, de forma independiente del molde. TdT requiere un cebador de ADN monocatenario en presencia de Mg2+ (tres nucleótidos de longitud mínima).

La fosfatasa alcalina: Se utiliza para eliminar los grupos 5′ -fosfato de los ácidos nucleicos con el fn de evitar la recirculación de los vectores de ADN en los experimentos de clonación. La fosfatasa alcalina no hidroliza los enlaces fosfodiéster.

T4 Polinucleótido quinasa: cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde una molécula de ATP al extremo 5′ -OH de un ácido nucleico (ADN o ARN, sin limitaciones de tamaño), el intercambio de grupos 5 ′fosfato, o la fosforilación de los extremos 3′ de los mononucleótidos. Desoxirribonucleasa: es una endonucleasa que actúa sobre el ADN de cadena simple o doble (aislado o incorporado en la cromatina). La DNasa I se utiliza para la traducción en cadena del ADN, para generar fragmentos aleatorios para la secuenciación dideoxídica, para digerir el ADN en preparaciones de ARN o de proteínas, y para el análisis de las interacciones ADN-proteína en el DNase footprinting. Exonucleasa III: i) actividad 3′ -exonucleasa: la exonucleasa III cataliza la eliminación de los mononucleótidos de los extremos 3′ -OH del ADN de doble cadena; ii) actividad fosfatasa: la exonucleasa III desfosforila las cadenas de ADN que terminan con un grupo fosfato 3′ (este tipo de cadena suele ser inerte como cebador e inhibe la acción de la ADN polimerasa); iii) actividad RNasa H: la exonucleasa III degrada las cadenas de ARN de los híbridos de ADN/ARN; iv) actividad endonucleasa: la exonucleasa III escinde las bases apurínicas y apirimídicas del esqueleto de fosfato de azúcar en el ADN. Otra característica signifcativa de la exonucleasa III es su relativa especifcidad para el ADN de doble cadena. Cuando esta enzima actúa como endonucleasa, genera un hueco en las muescas del ADN de doble cadena, mientras que cuando actúa como exonucleasa, genera un extremo que sobresale en 5′.

Exonucleasa VII: degrada específcamente el ADN monocatenario, sin actividad aparente sobre el ARN o los híbridos ADN/ARN.

RNAsa A: La RNasa A se utiliza para reducir la contaminación por ARN en las preparaciones de ADN plasmídico y para mapear mutaciones en el ADN o el ARN mediante la escisión de desajustes, ya que escinde el ARN en los híbridos ARN/ARN en los sitios de desajuste de un solo nucleótido.

RNAsa H: degrada específcamente el ARN en los híbridos ARN/ADN. Permite la eliminación de sondas de ARN de hibridaciones anteriores, o la eliminación de colas poli-A en el extremo 3′ de los ARNm.

Nucleasa S1: es una herramienta muy útil para medir el grado de hibridación (ADN-ADN o ADN-ARN), sondear regiones de ADN dúplex y eliminar el ADN monocatenario de extremos salientes generado por las enzimas de restricción. Esta enzima degrada el ARN o el ADN monocatenario en 5′ mononucleótidos, pero no degrada el ADN dúplex o los híbridos de ARN-ADN en conformación nativa.

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Clasificación de enzimas de restricción De acuerdo a su función las enzimas de restricción se han clasifcado en tipo I, II, III. Tipo I Las enzimas que pertenecen a este grupo reconocen una secuencia especifca de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en cualquier secuencia del ADN y a una distancia aproximada de 1000 pb del sitio de corte; además tienen la función de metilar su propio genoma. Estas enzimas necesitan adenosin trifosfato (ATP) para moverse a lo largo de la molécula de ADN desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte. Tipo II Son enzimas que reconocen secuencias específcas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de reconocimiento. Estas enzimas solo tienen actividad de restricción no de metilación y son las utilizadas en ingeniería genética, ya que cortan el ADN en secuencias especifcas reconocidas. Requieren Mg2+ como cofactor y no requieren de ADN. Las secuencias de reconocimiento de estas enzimas son palindromicas, es decir, son secuencias que se leen igual en las dos cadenas de ADN. Tipo III Estas enzimas reconocen una secuencia específca y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana (aproximadamente de 25 a 27 pares de bases corriente abajo del sitio de reconocimiento). Tienen, al igual de las de tipo I, actividad de metilasa y requieren de ATP para desplazarse a lo largo de la molécula de ADN.

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Extracción de ADN

Extracción de ADN por la técnica fenol-cloroformo Esta técnica se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructuras subcelulares mediante el empleo de detergentes con la posterior eliminación de las proteínas mediante su extracción y la de componentes lipídicos con solventes orgánicos. Esto deja al ADN puro listo para su separación por precipitación en soluciones alcohólicas.

Lisis de las células y liberación del ADN El primer paso en la extracción es la homogeneización del tejido y la lisis con detergentes (Triton o docedil sulfato sódico, SDS) capaces de romper las membranas celular y nuclear, y liberar el ácido nucleico de las células de donde se extraerá el ADN. El procedimiento de lisis celular es crítico y debe ser lo sufcientemente agresivo como para lograr la fragmentación del tejido y la rotura de la membrana celular, sin dañar el ácido nucleico. La disgregación del tejido y su homogeneización se llevan a cabo en un buffer de lisis, que contiene sales, un detergente y proteinasa K, que libera el ADN de las histonas con las que se encuentra empaquetado y proteoliza proteínas celulares. La incubación con la enzima se realiza por 2 horas a 65°C. En el caso del ADN, la homogeneización se lleva a cabo con un homogeneizador manual para evitar la rotura mecánica de la molécula; para el ARN se emplea un homogeneizador eléctrico que gira a unas 200 a 1000 rpm. En el caso de células con pared celular, como las células vegetales, se pref ere el empleo de sonicadores, los cuales, mediante ondas de sonido, rompen la pared celular y la membrana celular y nuclear, para liberar el ADN. La inactivación de nucleasas intracelulares previene la digestión enzimática de los ácidos nucleicos, lo que permite lograr la obtención de fragmentos relativamente largos de ADN y ARN. La lisis celular y la inactivación de las nucleasas intracelulares en general se llevan a cabo en el mismo paso, ya que la solución de lisis está

Resumen primer parcial: ingeniería genética compuesta por sales caotrópicas, como el EDTA, que secuestra cationes divalentes y, por lo tanto, inactiva las ADNasas.

Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos Al concluir la lisis celular y la inactivación de nucleasas, se retiran los restos celulares, proceso conocido como purifcación. Los métodos de purifcación de ácidos nucleicos combinan estrategias tan diversas como la extracción/precipitación, la cromatografía, la centrifugación, la electroforesis y la separación por afnidad. Para la extracción por la técnica del fenol-cloroformo, se utiliza una solución que tiene una relación 25:24:1 v/v para el fenol:cloroformo:alcohol isoamílico; generalmente se añade hidroxiquinolina al 0.1%, que funciona como antioxidante del fenol, un inhibidor parcial de ARNsas, quelante débil de iones metálicos, y que ayuda a identifcar la fase orgánica por el color amarillo que le confere. El alcohol isoamílico se emplea para reducir la espuma que puede generarse al agitar esta solución. Esta solución desnaturaliza las proteínas (entre ellas las nucleasas) y mantiene la separación de la fase orgánica y acuosa tras la centrifugación de la muestra. L a formación de dos fases con propiedades de solubilidad particulares a) una fase orgánica(fenólica) en la parte inferior del tubo de precipitado que contiene lípidos, proteínas y debris celulares, y b) una fase acuosa en la parte superior (menos densa), que contiene los ácidos nucleicos y otras pequeñas moléculas hidrosolubles. El ADN es poco soluble en fenol, por lo que previamente suele estabilizarse con una solución amortiguadora de Tris que lo mantiene en un pH de 8.0 a 8.5, lo que hace que el ADN permanezca en la fase acuosa. La modifcación del pH de 8.5 a 5.2 en esta solución puede favorecer la extracción de ARN frente a la de ADN.

Precipitación de ADN El ADN disuelto en la solución acuosa se precipita añadiendo alcohol absoluto (isopropanol o etílico), ya que los ácidos nucleicos son insolubles en soluciones alcohólicas. Cuando se emplea etanol (EtOH), la cantidad que se requiere para la precipitación es dos veces el volumen de la fase acuosa, mientras que con isopropanol (IprOH) se demanda solamente 0.7 veces el volumen de fase acuosa. Para facilitar la precipitación también suelen añadirse cationes monovalentes (K+, Na+, NH4+) a la solución de ácidos nucleicos cargados negativamente, con el f n de generar sales insolubles en alcohol de fácil precipitación.

Resumen primer parcial: ingeniería genética La precipitación se favorece incubando a bajas temperaturas (–20°C); una centrifugación posterior permite la obtención de una pastilla o botón del ácido nucleico en el fondo del tubo, al decantar el alcohol.

Lavado del ADN El botón de ADN obtenido en la precipitación se lava con etanol al 70% por, al menos, dos ocasiones. El contenido de alcohol de esta solución (70%) mantiene al ADN precipitado, y el H2O (30%) permite la disolución de las sales presentes. Después de los lavados, se seca el botón, lo que permite la evaporación del alcohol.

Disolución del ADN y adición de ARNsa Inmediatamente después de la evaporación del alcohol, el botón de ADN se disuelve en soluciones que aseguren supreservación, como agua estéril y libre de ADNsas, o bien soluciones amortiguadoras, como el buffer Tris EDTA

Espectrofotometría El fundamento de la espectrofotometría es que cualquier solución que contenga moléculas suspendidas permite el paso de un haz de luz a través de ella en proporción inversa a la cantidad de moléculas que contiene. Los nucleótidos de ADN y ARN presentan la absorción máxima a una longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV). En la celda del espectrofotómetro un haz de luz atraviesa la solución de ácidos nucleicos y, cuando ha pasado por la muestra, un fotodetector mide la intensidad de luz absorbida. Mientras más luz absorba la muestra (absorbancia) mayor será la concentración de ácidos nucleicos. La densidad óptica (OD) es la unidad de absorbancia y tiene valores particulares para cada molécula específca en una determinada longitud de onda por unidad de distancia.

Resumen primer parcial: ingeniería genética En el caso de los ácidos nucleicos, una OD de 1 a 260 nm equivale a 50 μg/ml de ADNds, 37 μg/ml de ADNss, 40 μg/ml de ARN o 33 μg/ml de oligonucleótidos. Según estos valores, se estableció la siguiente fórmula para el cálculo de la concentración de los ácidos nucleicos: μg/μl de AN = OD a 260 nm × Dilución × constante / 1 000 En donde: OD a 260 nm: absorbancia del ácido nucleico a 260 nm de longitud de onda.

Contaminación con proteínas: índice 260÷280 Dado que las proteínas (en particular los aminoácidos aromáticos) absorben luz a una longitud de onda de 280 nm, por lo común el índice de absorción 260÷280 nm se utiliza para valorar la pureza de los ácidos nucleicos con respecto a la contaminación con proteínas. Cuando éste se encuentra entre 1.8 y 2.0, se considera óptimo, ya que valores cercanos a 1.8 indican que la muestra contiene casi exclusivamente ADN; para el ARN el índice óptimo es de 2.0. La presencia de proteínas hará disminuir este cociente, por lo que si la relación 260÷280 es menor que 1.8 la cantidad de proteína en la muestra es alta y es conveniente realizar un nuevo proceso de extracción. Un índice mayor que valores de 2.0 indica una rotura de las cadenas de los ácidos nucleicos, y se considera que es un ácido nucleico de calidad insufciente, por lo que en este caso también se recomienda una nueva extracción.

Preservación del ADN El ácido nucleico se mantiene en congelación (–80°C es la temperatura recomendada) hasta su empleo.

Extracción de ARN Al realizar la extracción de ARN de células eucariotas existen dos posibilidades: extracción de ARN total (ARNm, ARNr y ARN de transferencia, ARNt) y extracción oclusiva de ARNm. Es menos complejo y generalmente más barato la extracción de ARN total, y a menos que el ARNm sea sumamente escaso se opta por esta opción. El lisado celular se diluye con una solución alcohólica y se coloca en una columna de resinas de intercambio aniónico. La resina consiste en cuentas de sílica con superfcie hidrofílica con tamaño de partícula reducido, hechas con cantidades elevadas de grupos dietil-amino-etil (DEAE). La purifcación se basa en la interacción de estos grupos DEAE cargados positivamente con los grupos fosfatos (cargados negativamente) del ARN. El ARN unido a la columna se eluye con soluciones iónicas acuosas. El proceso es rápido, aunque la cantidad de ARN suele ser limitada; sin embargo, la calidad del ARN obtenido −de la cual se dice es la equivalente a dos rondas de purifcación con gradientes de CsCl− es mayor, ya que no hay arrastre de fenol.

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Consideraciones especiales al trabajar con ARN La molécula de ARN es sumamente lábil, por lo que la clave en la extracción es evitar su degradación por acción de ribonucleasas propias de la célula. Los protocolos existentes se basan en una rápida inactivación de ARNsas endógenas, muy estables y que no requieren de cofactores para funcionar. Es muy importante tomar precauciones para evitar la contaminación con ARNsas exógenas, por ejemplo, tratar el agua y soluciones salinas con inhibidores de ARNsas−como el DEPC al 0.1%−, que inactiva las ribonucleasas por modifcaciones covalentes. Si es posible, se recomienda el empleo de pipetas, puntillas y soluciones exclusivas para trabajar con ARN. El material de vidrio debe esterilizarse por calor seco por 4 horas a 150°C, mientras que el material plástico debe ser nuevo y estéril, o bien debe enjuagarse con cloroformo, ya que la esterilización por autoclave no inactiva por completo las ARNsas.

Electroforesis Gel La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con la f nalidad de evitar perturbaciones mecánicas durante la separación. El soporte idóneo es un gel semisólido o gelatinoso, compuesto por polímeros que forman una especie de malla o microporos tridimensionales a través de los cuales avanzan las moléculas, según el peso molecular, lo que permite la separación por tamaño de los diferentes componentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida.

Geles de agarosa La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, que se disuelve fácilmente en temperatura de 50 a 60ºC, se torna líquida y se solidifca cuando se enfría formando un gel altamente poroso. Para elaborar el gel se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solución amortiguadora adecuada de la misma composición y concentración que el buffer de corrimiento y se calienta hasta formar una solución. Sin dejar enfriar se vacía inmediatamente sobre un molde de forma rectangular y en uno de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine con la fnalidad de generar los pocillos u orifcios donde se colocarán las muestra. La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto tóxico y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados, según la concentración de agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del

Resumen primer parcial: ingeniería genética poro obtenido; esto es, a mayor concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son pequeños la migración del ácido nucleico es más lenta. En la electroforesis de un plásmido, por ejemplo, se visualizan tres conformaciones distintas de la misma molécula: la forma superenrrollada, la semirrelajada y una relajada. Esto se refleja en tres bandas de “tamaño” diferente, aunque se trate del mismo plásmido.

Geles de acrilamida La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte, con el que se pueden generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. El gel de poliacrilamida es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. El tamaño de poro de un gel de acrilamida está determinado por la concentración total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida). se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se encuentra en disolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta, con el resultado de que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. Es capaz de soportar mayores voltajes que la agarosa y es susceptible de teñirse por varios procedimientos, y también puede desteñirse en caso necesario. Los geles de acrilamida pueden digerirse para extraer fracciones separadas (bandas) o desecados para su exposición radiográfca y registro permanente. La electroforesis con geles de acrilamida siempre se realiza en cámaras verticales. La electroforesis de proteínas emplea geles de acrilamida de dos capas de gel a diferente concentración de acrilamida, un gel superior o concentrador y un gel inferior de separación o de resolución.

Buffer de corrimiento El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida. Éste proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, a un pH 8.3.

Marcador de peso molecular Son moléculas de ADN o de proteínas que permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis.

Buffer de carga Este amortiguador tiene como f n brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además, monitorear el corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de muestra. El buffer de carga de ácidos nucleicos contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol. Mientras que el buffer de carga para proteínas contiene Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul de bromofenol. En el caso de que se deseen condiciones desnaturalizantes y reductoras, deberá añadirse betamercaptoetanol a este buffer y habrá que calentar las muestras a 95°C por 5 minutos.

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Transiluminador ultravioleta El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, excitando la molécula cromogénica que emite energía fluorescente que permite visualizarla.

Electroforesis de ácidos nucleicos El método más común para la electroforesis de ADN es elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentración de 0.5 a 2%. La carga eléctrica de la molécula de ADN la otorgan sus grupos fosfato, de c...