- samenvatting methoden: 1e jaar biomedische wetenschappen te KuLeuven PDF

Preview

Summary

samenvatting methoden: 1e jaar biomedische wetenschappen te KuLeuven...

Description

Hoofdstuk 10: chromatografie o 2 componenten: stationaire en mobiele fase een mengsel van stoffen wordt opgelost in de mobiele fase en terwijl die in beweging is, wordt die in contact gebracht met de stationaire fase. Stoffen in de mobiele fase die minder intrageren met de stationaire fase, bewegen sneller dan stoffen die meer intrageren  scheiding toepassingen: o analyse van de resultaten van chemische reacties o zuiverheid van medicatie o contaminanten in voedsel en drank o drugs en doping bij dieren en mensen

papier/ dunna laag chromatografie elutieprincipe: het eluens (mobiele fase) lost componenten op en voert deze mee door de stationaire fase. De elutiesnelheid hangt af van: o oplosbaarheid van de componenten o affiniteit van de componenten met de stationaire fase o affiniteit van het elutiemiddel met de stationaire fase mobiele fase: solvent waarin componenten oplossen stationaire fase: bij papierchromatografie: papier bij dunne laag chromatografie: dunne laag kleine korrels op glas-of kunststofplaat kwantificatie: o vertragingsfactor of retentiefactor (Rf) Rf = A/ B  A: loopafstand component, B; loopafstand eluens front o hoe meer polair het eluens, hoe sterker het eluens zelf geadsorbeerd wordt door de polaire stationaire fase en des te effectiever de elutie o water en ethanol zijn veel sterker dan een apolair eluens zoals benzeen of cyclohexaan en verdringen componenten van de stationaire fase voordelen van dunne laag chromatografie (=TLC) o betere kwantitatieve bepaling mogelijk o meer mogelijkheden voor stationaire fase

kolomchromatografie Kolom (glazen buis) is gevuld met stationaire fase. Een klein volume van staal of standaar wordt opgebracht. Ook het eluens wordt opgebracht. De componenten worden gescheiden en onderaan afzonderlijk opgevangen. De afremming (retentie) van een component wordt veroorzaakt door verschillende moleculaire eigenschappen, die gekoppeld zijn aan een scheidingsprincipe: o adsorptie o oplosbaarheid/ verdeling

o molecuulgrootte/ affiniteit o ionlading/uitwisseling adsorptie: moleculen worden aan het opppervlak van de stationaire fase geadsorbeerd oplossing/ verdeling: moleculen lossen op in de stationaire fase  een evenwicht tussen de concentratie in de stationaire en die in de mobiele fase solvent: het solvent moet vrij zijn van deeltjes en wordt daarom gefiltreerd. Het solvent moet vrij zijn van opgeloste lucht en wordt daarom tevoren ontgast Adsorptie en verdelingschromatografie: polariteit van oplosmiddel is van groot belang Normal phase and reversed phase: Normal phase: eluens is minder polair dan de stationaire fase Reversed phase: eluens is meer polair dan de stationaire fase Uitsluiting op basis van molecuulgrootte Kleine moleculen worden vertraagd doordat deze doordringen in de holtes van de stationaire fase en daardoor langer in deze fase verblijven. Grote moleculen doen dit niet. De retentie wordt dus groter naarmate de moleculen kleiner zijn Affiniteit Stereospecifieke binding: moleculen passen precies op andere. Er wordt maar 1 type eiwit gebonden  zuivering van eiwitten Ionlading/ uitwisseling Scheiding door lading: bij een ladingsverschil worden ionen vastgehouden en omgekeerd. Hoe hoger het ladingsverschil, des te sterker de remming  zuivering van biochemische stoffen. Kationenwisselaar: bevat negatief geladen/zure groepen  uiwisseling van positieve kationen Anionenwisselaar: bevat positief geladen/ basische groepen  uitwisseling van negatieve anionen Isoelektrisch punt (IEP) pH waarbij de nettolading van het eiwit 0 is. Het isoelektrisch punt kan bepaald worden met isoelektrische focussering o pH boven IEP, eiwit is negatief  anionenwisselaar o pH onder IEP, eiwit is positief  kationenwisselaar bij een grotere afwijking pH van IEP  grotere affiniteit

basisbegrippen van chromatografie Piek breedte en positie bepalen de scheiding

hoofdstuk 11: elektroforese en western blot introductie elektroforese principe scheiding van geladen deeltjes doorheen een gel onder invloed van een elektrisch veld. Het elektrisch veld doet de geladen deeltjes bewegen, de gel werkt als zeef  scheiding volgens lading en/of massa. Twee gelsystemen: o agarose gel: is een polysaccharide  polymeer van agarobiose. Afkomstig van zeewier, niet-toxisch, horizontale gels. Wordt gebruikt voor de scheiding van nucleinezuren (DNA/RNA) o polyacrylamide gel is een cross-linked polymeer van acrylamide. Acrylamide is neuro-toxisch, verticale gels. Wordt gebruikt voor de scheiding van eiwitten. Polyacrylamide gel heeft een kleinere portiegrootte dan agarose gel  scheiding van kleine DNA fragmenten

agarose gel elektroforese scheiding van nucleinezuren (DNA/RNA) op een agarose gel 1. Gieten agarose gel: Agarose poeder met buffer opwarmen  agarose smelt. Daarna de agarose laten afkoelen in een gel tray met kam 2. Staalvoorbereiding: vermengen van DNA/RNA staal met laadbuffer Kleurstof om migratie van het staal te volgen. Glycerol toevoegen om staal zwaarder te maken dan elektroforesebuffer 3. Gel lopen DNA ladder  mengel van fragmenten van gekende lengte 4. Visualiseren DNA/RNA via DNA/RNA bindende kleurstoffen Deze worden toegevoegd bij het maken van de gel of aankleuring na het lopen van de gel.  ethidiumbromide (EtBr): zichtbaar signaal onder UV licht (DNA wordt beschadigt), is zeer gevoelig, toxisch en mutageen/carcinogeen.  SYBRsafe: is zichtbaar onder blauw licht (en UV), zeer gevoelig, en is minder mutageen maar wel toxisch en moet dus met de nodige voorzichtigheid gehanteerd worden.

Toepassingen van agarose gel electroforese o Nakijken van de lengte van DNA fragmenten  ladder als referentiepunt o Scheiden van DNA fragmenten voor opzuivering o Nakijken integriteit van RNA Kies een gelpercentage dat aangepast is aan de lengte van de DNA fragmenten dat je wilt analyzeren

Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) SDS-page: Scheiding van eiwitten volgens massa. SDS= sodium dodecyl sulfaat  ionisch detergent dat bindt aan AZ en zorgt voor het ontvouwen van een enwit en voor een uniforme negatieve lading. Deze ongevouwen linaire structuur met een negatieve lading is propotioneel aan de lengte en dus aan de massa van het eiwit  scheiding van eiwitten volgens massa o Stacking gel: deze ligt bovenaan de gel. Deze heeft een lager % polyacrylamide gel. Functie van de stacking gel: concenteren van het staal voor het in de scheidingsgel terecht komt  betere resolutie scheiding en scherpere banden in de scheidingsgel o Scheidingsgel: ligt onder de stacking gel. Deze heeft een hoger % polyacrylamide Functie scheidingsgel: scheiding van eiwitten volgens lengte Werking SDS-PAGE 1. Eiwitstalen en marker worden geladen op verticaal SDS-PAGE systeem 2. Migratie van de stalen na aanleg van een elektrisch veld 3. Aankleuren van de eiwitten met Coomassie of Silver stain

Isoelectric focussing (IEF)  scheiding van eiwitten volgens lading principe: o Eiwitten hebben een lading afhankelijk van de AZ-samenstelling Lys, Arg en His  positief Asp, Glu  negatief o De lading van deze AZ is afhankelijk van de pH o Bij een bepaalde pH heeft een eiwit geen nettolading = isoelektrisch punt (IEP) o AZ-samenstelling bepaalt het IEP  scheiding van eiwitten volgens IEP Werking IEF 1. aan een lage pH hebben eiwitten een positieve lading, aan hoge pH een negatieve lading 2. migratie van de eiwitten door het aangelegde elektrische veld, eiwtten veranderen van lading doot pH gradient

3. als een eiwit de regio bereikt waar de pH = IEP, stopt het met migreren omdat het geen lading meer heeft Om alle AZ bloot te stellen aan een elektrisch veld, is er een goede denaturatie nodig  urea Er is een gel nodig met geimmobiliseerde pH gradient  immobilines

2D elektroforese scheiding in 2 dimensies voor complexe eiwitmengsels o eerste dimensie = IEF o tweede dimensie = SDS-PAGE Voordelen: o goede resolutie van eiwitten: 2000 spots per gel o detectie posttranslationele modificaties o detectie van eiwitten die al dan niet aanwezig zijn in verschillende stalen nadelen: o niet geschikt voor hydrofobe eiwitten o beperkt door pH regio o analyse en kwantificatie zijn moeilijk o beperkte hoeveelheid eiwit kan geladen worden

native PAGE scheiding van eiwitten volgens lading, massa en vorm doordat er geen denaturatie van het eiwit gebeurt toepassing: o opzuiveren van eiwitten met enzymatische activiteit o bepalen van quaternaire stuctuur van eiwit

capillaire elektroforese o elektroforetische scheiding van biomoleculen in een capillair op een chip o snelle scheiding door een sterk elektrisch veld o detectie met fluorescente kleurstoffen werking van capillaire elektroforese 1. stalen worden aangebracht in sample wells 2. stalen worden 1 na 1 geinjecteerd in scheidingskanaal waar de staalcomponenten elektroforetisch gescheiden worden 3. staalcompontent worden gedetecteerd via fluorescente kleurstoffen 4. computer zet het gedetecteerde signaal om in een elektroferogram en/of gel-achtig beeld toepassingen: o analyze van RNA kwaliteit

western blot o SDS-PAGE en western blotting

Elektroblotting of transfer: eiwitten transfereren van gel naar membraan door aanleg van een elektrisch veld. Geen transfer op plaatsen waar er lucht tussen gel en membraan zit  luchtbelle absoluut vermijden

elektroblotting

Immunodetectie: o Blocking: bezetten van aspecifieke bindingsplaatsen op het membraan met melk,.. o Primair antilichaam: antilichaam dat specifiek bindt aan het eiwit van interesse o Secundair antilichaam: gericht tegen primair antilichaam. Bevat een chemische modificatie om signaaldetectie te doen  chemiluminiscentie en fluorescentie

 chemiluminiscentie: chemische reactie waarbij energie vrijkomt onder de vorm van licht. Het secundair antilichaam is gekoppeld aan een alkalisch fosfatase of peroxidase  fluorescentie: secundair antilichaam gekoppeld aan eer fluorofoor Voordeel: je kan in meerdere detectiekanalen werken en eiwitten van dezelfde grootte detecteren zonder strippen. Het is meer kwantitatief dan de chemiluminescentie Nadeel: minder gevoelig

Hoofdstuk 12: celbiologische methoden Flow cytometrie: Principe: FACS, maar geen scheiding van cellen, enkel analyze van merkers Doel: bepalen welk % van de cellen een bepaalde merker bevat Werking: 1. Eiwitten van interesse (merkers) worden aangekleurd met fluorescent gelabeld antilichaam 2. Intracellulaire merkers en of cel oppervlakte merkers 3. 1 of meerdere merkers worden tegelijk genanalyzeerd 4. resultaten worden geplot in een histogram of scatterpolt voor enkele duizenden cellen

celproliferatie  BrdU test doel: celproliferatie meten principe: Bromodeoxyuridine (BrdU) is een thymidine analoog dat tijdens de S-fase van de celcyclus wordt ingebouw werkwijze: 1. cellen opgroeien 2. BrdU toevoegen voor 2-24 uur, en de cellen verder laten opgroeien 3. Cellen permeabiliseren en een gmerkt anti-BrdU antilichaam toevoegen 4. Merker meten

celleefbaarheid  MTT test doel: aantal levende cellen bepalen principe: levende cellen hebben een mitochondriaal dehydrogenase dat het gele oplosbare MTT omzet naar het paarse onoplosbare formazan  kleuring is evenredig met het aantal levende cellen werkwijze: 1. Cellen laten opgroeien in een 96- well plaat 2. Gele MTT oplossing toevoegen en deze enkele uren laten incuverren in celcultuurincubator 3. Formazan oplosmiddel toevoegen 4. Optische densiteit meten op muti-well plaatlezer

Celdood  tunel test doel: meten van apoptose principe: bij apoptose treedt er DNA fragmentatie op. DNA fragmentatie wordt gedetecteerd door inbouw van Bromo-dUTP in DNA door terminaal deoxynucleotidyl transferase werkwijze: 1. Weefselcoupe maken en fixeren of cellen op draagglaasje fixeren en permeabiliseren 2. Terminaal deoxynucleotidyl transferase toevoegen samen met Br-dUTP 3. Ingebouw Br-dUTP detecteren met gemerkt antilichaam tegen BrdU 4. Detectie met fluorescentie of kleuring

Propidium lodide (PI) flow cytometrie Doel:dode cellen tellen Principe: PI kan alleen dode cellen binnendringen, intercaleert met DNA en wordt fluorescent Werkwijze: 1. Cellen incuberen met PI 2. Flow cytometrie: forward scatter VS PI fluorescentie

annexine V/ propidium lodide (PI) flow cytometrie doel: levende, vroeg apoptotische en dode cellen onderscheiden en tellen principe: PI kan alleen dode cellen binnendringen, intercaleert met DNA en wordt fluorescent. Bij start apoptose flipt fosfatidylserine van de cytoplasmatische zijde van de celmembraan naar de buitenzijde, zodat gelabeld annexine V kan binden aan fosfatidylserine werkwijze: 1. Cellen incuberen met PI en gelabeld annexine V 2. Flow cytometrie: Annexine V VS PI fluorescentie

Celcyclus...