Tema 2. Sedimentación PDF

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Tema 2: Sedimentación Las técnicas de sedimentación pueden ser tanto preparativas como analíticas (si queremos conocer el coeficiente de sedimentación de un componente celular). Sobre una partícula que se está centrifugando actúan 3 fuerzas:   

Fuerza centrífuga (Fc): empuja la partícula hacia el fondo del tubo. Fuerza de flotación (Fb): la que debe realizar la partícula para desplazar el líquido. Fuerza de frenado (Fd): presión del líquido para que la partícula no se mueva (rozamiento).

Estas tres fuerzas determinan la velocidad de sedimentación de la partícula. En el momento en que empieza la centrifugación, la partícula se acelera hasta que se estanca la velocidad (aceleración es 0). En este punto, la suma de las tres fuerzas debe ser 0 (F=ma=m·0). Como no se conoce el volumen de la partícula es necesario hacer una serie de igualdades y acabar expresando la masa de la disolución desplazada como un cociente de densidades. De esta forma, la velocidad (en cm/s) de una partícula que sedimenta es:

De la fórmula se deduce que cuando la densidad de la partícula es igual a la del medio, esta no se moverá (v=0). El coeficiente de sedimentación debe ser una medida dependiente al máximo de la molécula y al mínimo del aparato, por lo que, para calcularlo, se divide la velocidad de la partícula entre la velocidad de la centrifuga (w) y el radio de giro (x).

S

m(1   D /  P ) fr

De esta forma, se elimina el efecto de la centrífuga, pero no el del resto de las condiciones. Para ello, se define el coeficiente de sedimentación estándar (So20,w) como el coeficiente de sedimentación en agua, a 20oC y extrapolado a concentración 0 (se calcula la v a diferentes concentraciones, se realiza una recta y se calcula la v a concentración 0, que será mayor que a cualquier otra concentración).

El coeficiente de sedimentación estándar es característico para cada sustancia y proporciona información sobre la masa y forma de la partícula. En las técnicas de sedimentación se usan centrífugas y ultracentrífugas, que presentan los siguientes elementos:     

Rotor: espacio en que se colocan las muestras. Eje: determina la duración del aparato. Cámara: donde tiene lugar el giro del rotor. Control de la temperatura de la cámara para evitar el sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción con el aire. Vacío en la cámara en ultracentrífugas y a altas velocidades para evitar dicha fricción.

Ultracentrífuga analítica Se utiliza para determinar el coeficiente de sedimentación de una molécula, su peso molecular, la pureza de la muestra... Presenta acoplado un espectrofotómetro que mide la absorbancia cada vez que la muestra realiza una rotación, de forma que permite medir como va aumentando la concentración hacia el final del tubo. La ultracentrífuga analítica solo puede medir una muestra a la vez y es necesario un contrapeso opaco. Esta técnica permite determinar el desplazamiento del soluto en función del tiempo gracias a las curvas de absorbancia, en las que se observan frentes. Esto sirve para determinar la velocidad de sedimentación, realizar estudios de asociación de macromoléculas (por ejemplo, si la muestra contiene DNA e histonas y se observa si se forma un frente o varios, es decir, si se ha formado cromatina o ambos componentes quedan separados, respectivamente) o de homogeneidad de la muestra (similar a lo anterior). De esta forma, al hacer la derivada de la curva de absorbancia, si solo se genera una línea es que hay una sola molécula, dos picos se corresponden con dos moléculas, y una curva, con varias moléculas que se mueven a diferente velocidad.

Tipos de rotores 





Rotor angular: es el más común. El tubo se coloca parcialmente inclinado, de forma que el ángulo de giro del fondo del tubo es mayor y es donde sedimentará la partícula. Rotor flotante: cuando empieza a girar, los tubos adquieren una posición horizontal. Este tipo de rotor es útil para separar partículas con densidades similares, ya que la longitud en la que las partículas se pueden separar es mayor. Rotor vertical: el tubo se coloca en posición vertical y las partículas sedimentan también en este sentido. Cuando se para la centrífuga las bandas pasan a una posición horizontal, de forma que se pueden mezclar bandas y la resolución será peor. La ventaja respecto a los rotores flotantes es que se puede centrifugar durante más tiempo sin que el eje se resienta.

La velocidad de centrifugación pueden darse en rpm o en G (si la damos en rpm en un protocolo debemos dar también el radio del rotor).

Centrifugación preparativa, diferencial: fraccionamiento celular Tras realizar la extracción celular, centrifugando a velocidades crecientes la muestra se pueden separar los diferentes compartimentos o moléculas celulares. En este método siempre existe cierta contaminación.

Centrifugación preparativa, zonal: gradientes En este caso no se utiliza una muestra la muestra diluida en un líquido en todo el tubo, sino una muestra muy concentrada que se coloca sobre un medio de concentración creciente hasta el fondo. De esta forma, utilizando una centrifuga de rotor flotante, las partículas se irán desplazando y permanecerán en la zona donde la densidad del medio sea igual a la suya. Finalmente se fracciona la muestra: se separan las diferentes concentraciones en tubos diferentes.

Esta técnica se utiliza, por ejemplo, para separar cápsides víricas vacías y llenas.

El gradiente utilizado en la sedimentación puede ser:  

Discontinuo: se van colocando capas de menor densidad desde el fondo. Las partículas quedarán atrapadas en las interfases de estas capas. Continuo: existen dos cisternas con una líquido concentrado al 0% (más atrás) y otro al 100% (más adelante) conectadas entre sí y al tubo donde se quiere crear el gradiente. Cuando se abre el paso caerá primero la solución concentrada al 100% por que está delante, pero también avanzara la del 0% que se mezclará con la del 100% haciendo que sea menos concentrada, y así sucesivamente.

Para separar diferentes tipos de moléculas se utilizan gradientes específicos. Se puede determinar experimentalmente el coeficiente de sedimentación con ultracentrífugas analíticas, pero también extrapolarlo a través de una recta patrón: se centrifugan varias moléculas en un gradiente continuo, se realiza el fraccionamiento y se genera la gráfica. Finalmente, se centrifuga la molécula de interés en las mismas condiciones y, en función de la fracción en que eluye, se extrapola su coeficiente de sedimentación.

Centrifugación isopícnica Se disuelve una serie de partículas en un medio en que también hay una sal disuelta (generalmente CsCl). Esta mezcla se centrifuga durante muchas horas de forma que se consigue generar un gradiente de concentración de la sal, un gradiente autogenerado. A la vez que se genera este gradiente, las partículas se separan hasta encontrar la zona con su misma densidad. Esta técnica se usa, por ejemplo, para separar regiones ricas en GC y AT. Los gradientes de CsCl, sin bromuro de etidio, también permiten separar los diferentes elementos del núcleo (proteínas, DNA y RNA), que se separarán en este orden. El RNA es más denso, ya que en estas condiciones iónicas forma repliegues debido a complementariedad, mientras que el DNA, debido a su estructura de doble hélice, permanece estirado.

Si el gradiente se realiza con CsCl y bromuro de etidio, se puede separar las formas del DNA plasmídico: el relajado (nickado o de mala calidad) y el supercoiled (o de alta calidad). Siempre que se realiza una extracción de DNA plasmídico, este puede estar en ambas formas, por lo que puede ser interesante añadir este paso al protocolo de purificación. El bromuro de etidio es un agente intercalante que actúa estirando la doble hélice, pero al DNA supercoiled no puede acceder al estar tan empaquetado. Esto hace que disminuya la densidad del DNA relajado, que ya de por sí es más baja que la del supercoiled.

Las diferentes bandas generadas durante la centrifugación isopícnica pueden recuperarse por abajo, por arriba o por el lado, a través del propio tubo....