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BIOMEDICINA US...

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TEMA 2.4: CO-INMUNOPRECIPITACIÓN Si trabajamos en condiciones nativas (sin SDS, sin calentar, no desnaturalizantes) se preservan las interacciones de unas proteínas con otras. Inmunprecipitando las azul oscuro me puedo traer todas las proteínas que están interaccionando con la proteína que me interesa (las azul clarito). Así compruebo con qué proteínas interaccionan. Una vez extraigo del tubo las bolitas con proteínas (la proteína que me interesa con las que interacciona), desnaturalizo y hago mi Western blot.

Esto sirve como método para demostrar ex vivo la sospecha de que una proteína interacciona como otra. Es ex vivo y es una interacción proteína-proteína. *NOTA: -

In vitro: fuera del organismo, en tubos de ensayo a nivel molecular In vivo: tenemos al organismo completo Ex vivo: tenemos tejido o células del animal aisladas, pero no el organismo completo

ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) Las interacciones de ADN con proteínas se estudian con ensayos de movilidad en el gel. Tiene utilidad para demostrar que una proteína tiene afinidad con un fragmento de un ácido nucleico. Se hace in vitro. Vamos a tener nuestro ADN y lo vamos a juntar con la proteína purificada que sospecho que se va a unir. In vitro lo ponemos junto y hacemos una electroforesis. Se suelen hacer en poliacrilamida en vez de en agarosa. Si mi proteína se une al ácido nucleico estaría retardando la migración del ácido nucleico. Si no hay retardo es que no hay interacción. Se utiliza radiactividad porque la cantidad de ADN y de proteína que tenemos es muy pequeña.

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Se pueden mapear las regiones importantes para la expresión y así mapear la transcripción. Se usa para identificar interacciones entre proteínas y ADN que yo conozcan y que típicamente sean reguladores de la transcripción.

RIP (RNA-BINDING PROTEIN INMUNOPRECIPITATION) Es una inmunoprecipitación de una proteína en la que detecto si se me ha unido un ARN. Se emplea para estudiar la traducción ya que las proteínas con la que trabajamos se unen al ARN para regular su expresión. Hay que hacerlo en condiciones nativas. A partir de ahí se extrae el ARN y por RTPCR cuantitativa puedo ver si está lo que me interese.

PULLDOWN Esta técnica se basa en detectar interacciones proteína-proteína in vitro. Consiste en unas bolitas de distintos polímeros, como agarosa, con glutatión, que tiene afinidad por una proteína, la GST. Hay vectores específicos que expresan esa proteína con afinidad por el glutatión, pero que después pueden clonar la proteína que sea. La proteína de fusión es aquella con un sitio exógeno, es decir, con un cacho que no corresponde a mi proteína. A efectos prácticos, realmente funciona como la propia proteína real. Su ventaja es que le estoy poniendo una especie de etiqueta que permite purificarla. Lo mezclo con las bolitas y la puedo purificar porque las bolitas tendrán afinidad por todo lo que sean las GST. También voy a poder cortar, ya que va a haber sitios sensibles a proteasas.

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Quiero detectar si mi proteína X interacciona con Y. Se expresa la proteína Y, y si interacciona con X no se me pegan. Como control pudo usar GTS sola. Puedo detectar si ha emitido radiactividad o no, lo que da indicación de si hay o no interacción. Previamente debo tener la sospecha ya que necesitamos ambas. También sirve para mapear qué parte de la proteína es responsable de la interacción. Se hace clonándola por fragmentos con diferentes partes de la proteína. Así vamos afinando en qué parte de la proteína está la región que realmente está interaccionando.

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