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BLOQUE II: CÉLULAS

TEMA 3 – DINÁMICA DE LAS INTERACCIONES CÉLULA-MATRIZ EXTRACELULAR Hasta 1996, la matriz extracelular (ECM) solo se asocia con funciones estructurales. En 1966, Hauschka y Konigsberg demostraron que el colágeno intersticial induce la conversión de mioblastos en miotubos. En 1977 se demuestra la importancia de la matriz extracelular en las inducciones embrionarias, que implica la presencia de receptores para moléculas específicas en la superficie celular. En 1982 Bissell y colaboradores describen el modelo de la reciprocidad dinámica entre la matriz extracelular y el citoesqueleto/la matriz nuclear. Se descubre que un cambio en las interacciones con la matriz conlleva cambios en el citoesqueleto y el núcleo celular, por tanto, en la forma y función celular. Del mismo modo, estos dos pueden modificar la matriz extracelular. En resumen, célula y matriz se afectan mutuamente. La distribución de los complejos moleculares de la ECM no es estática, varía de tejido a tejido y durante el desarrollo, por etapas. La organización varía con el tipo de tejido y tiene profundas implicaciones en la función general del mismo. La diversidad en la composición, organización y distribución de la ECM resulta de la expresión diferencial de genes, así como de la existencia de splicing diferencial y modificaciones postraduccionales. La matriz extracelular tiene en general una serie de funciones como la estructural, de protección mecánica y química, de hidratación, función señalizadora y de selección de las señales, de eliminación de señales ya recibidas, reservorio de señales, etc. En particular, la actividad de factores de crecimiento y citoquinas puede verse modulada por la ECM de distintos modos, afectándoles de distinta forma, lo que depende de la composición de la matriz. La ECM puede actúa: -

como reservorio, uniendo factores de crecimiento y citoquinas protegiéndolos de ser degradados presentándolos de forma más eficiente ante receptores afectando a su síntesis guiando su localización a regiones particulares de forma que se afecta la actividad biológica facilitando un ambiente de señalización estable a la célula, con la habilidad de los dominios específicos de las moléculas de la ECM para unirse y activar factores de crecimiento específicos

Por lo tanto, la ECM puede afectar la concentración local y actividad biológica de estos factores. Por ejemplo, la presencia de más o menos fibras en la matriz la hará más dura o más blanda, respectivamente, lo que afectará a la forma en que interactúa con la 1

célula. En la Figura 1 vemos ambos casos: si la ECM es blanda, con pocas fibras, es fácilmente deformable y la unión no está sometida a mucha tensión, por lo que la célula desarrolla pocas fibras de actina para unirse; en cambio, si la ECM es rígida, con muchas fibras, no va a deformarse para facilitar la unión, por lo que la célula desarrolla mayor cantidad de fibras de actina para la sujeción.

Figura 1. Diferencias en la interacción célula-ECM dependiendo de la composición de esta última.

1. Transducción de la Señal durante las Interacciones Célula-ECM Las moléculas de la ECM interactúan con sus receptores en la célula y transmiten la señal directa o indirectamente, haciendo que se regule la expresión génica implicada en adhesión, proliferación, etc. Tres categorías principales clasifican las posibles interacciones célula-ECM que pueden dar lugar a la transducción de la señal.

1.1. Vía proteoglicanos e integrinas Proteoglicanos e integrinas de la membrana celular interaccionan con distintos epítopos de la ECM y están anclados a filamentos de actina del interior celular, conduciendo a la reorganización del citoesqueleto. Vía proteoglicanos o integrinas se da la activación de una serie de proteínas (algunas como RAS), cuyas reacciones desembocan en la activación de las MAPquinasas, reguladoras de la expresión/represión de genes relacionados con adhesión, des-adhesión y migración.

Figura 2. Vía de transducción de señales provenientes de la ECM, a partir de la interacción de proteoglicanos e integrinas con componentes de la matriz.

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1.2. Vía Integrinas y factores de crecimiento Receptores de integrinas se unen a sus ligandos de la ECM, activando elementos del citoesqueleto, como ocurría en el caso anterior. Pero los factores de crecimiento se unen a moléculas de la matriz y a sus receptores, que tienen actividad quinasa. Esta actividad quinasa activa fosfolipasas que hidrolizan fosfatidil inositol bifosfato dando inositol 3P (IP3) y diacilglicerol (DAG); IP3 se une a su receptor en REL, induciendo la liberación de Ca2+, que puede activar directa o indirectamente, cooperando con DAG a través de protein-quinasa C, la regulación génica. Los genes regulados implicados diferenciados en proliferación, diferenciación y mantenimiento del fenotipo diferenciado.

Figura 3. Vía de transducción de señales provenientes de la ECM, a partir de la interacción de integrinas y receptores de factores de crecimiento con componentes de la matriz.

1.3. Vía integrinas con liberación de proteasas Los receptores de integrinas (subunidades α y β de diferentes clases que pueden formar muchas combinaciones) se unen a moléculas de la ECM que contienen dominios específicos. Esto hace que se activen los genes que codifican para proteasas que se liberan en la matriz. La degradación de la matriz que causan, libera péptidos concretos que, a su vez, pueden interaccionar con receptores de superficie y/o liberar factores de crecimiento que se unirán a sus propios receptores activando proteínas G y quinasas, dirigiendo la expresión de genes necesaria para morfogénesis y apoptosis.

Figura 4. Vía de transducción de señales provenientes de la ECM, a partir de la interacción de integrinas con componentes de la matriz y la posterior liberación de proteasas que degradan la matriz.

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Estos tres mecanismos tienen finalidades diferentes y se pueden dar a la vez. Las interacciones entre células y moléculas de la ECM juegan un papel crucial durante el desarrollo (embriogénesis) y cura de heridas.

2. Desarrollo 2.1. Adhesión y migración La mayoría de estudios en procesos de gastrulación (formación de capas embrionarias), migración de las células de la cresta neural, angiogénesis (formación de vasos sanguíneos) y formación de órganos (epitelial). Por ejemplo, veamos qué ocurre con las células endoteliales del cordón umbilical a la hora de formar vasos sanguíneos. Durante la angiogénesis las células endoteliales interaccionan con moléculas de ECM y el tipo/conformación de la matriz resulta crucial en la migración de células y posterior desarrollo de vasos sanguíneos. Las HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) migran y dan lugar a la formación de estructuras tubulares tras 12 horas de cultivo en una matriz EHS (similar a lámina basal: contiene principalmente laminina, pero también colágeno IV, proteoglucanos y nidógeno). Si incubamos las mismas células sobre colágeno tipo I, pasadas 12 horas no se forman las estructuras tubulares; pero si se da tiempo a las células endoteliales a desarrollar su propia lámina basal (1 semana), sí se forman estas estructuras. Está confirmado tanto en cultivo como in vivo que alguno de los componentes de la lámina basal tiene un papel crucial en el desarrollo de estructuras tubulares tipo capilares. De hecho, si se preincuban las células con anticuerpos anti-laminina, se impide la formación de estructuras tubulares in vitro. La laminina tiene diferentes cadenas y lo que interesa es saber cuáles de sus dominios son los que promueven la angiogénesis. Se ha visto que péptidos sintéticos con secuencia SIKVAV, de la cadena A de la laminina, inducen la adhesión endotelial y elongación y promueven la angiogénesis. En cambio, la secuencia CDPGYIGSR-NH2, dominio presente en la cadena B de la laminina, bloquea la angiogénesis in vivo, y la migración de células endoteliales. El mecanismo de acción de estas moléculas se desconoce, pero está claro que secuencias de la misma molécula pueden presentar efectos contrarios. Se cree que, en función de las necesidades del organismo, se podría promover o dificultar la angiogénesis por medio de la exposición o el enmascaramiento de algunos de estos dominios (puede que mediante proteasas).

2.2. Proliferación La interacción de moléculas de ECM con células modula también la proliferación. La laminina presenta dominios de la cadena A que estimulan la proliferación de numerosas líneas celulares, y la molécula al completo promueve la proliferación de ciertos macrófagos. Por otra parte, hay moléculas de la ECM con efecto inhibitorio, como la heparina y moléculas similares que inhiben, entre otras cosas, la proliferación de células vasculares del músculo liso.

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2.3. Diferenciación Se han llevado a cabo estudios en queratinocitos, hepatocitos, células epiteliales de glándula mamaria. En el caso de los queratinocitos, que se encuentran en el epitelio estratificado de la piel (Figura 5), en particular, el estrato germinativo tiene una tasa elevada de proliferación y se encuentra en contacto con la lámina basal. Según se dividen, las células van ascendiendo y expresan marcadores que provocan su diferenciación. La interacción próxima con la lámina basal es responsable de la falta de diferenciación. Figura 5. Epitelio estratificado de la piel. Cuando se cultivan queratinocitos en suspensión, es decir, en cultivo se diferencian prematuramente: interviene el receptor Integrina α5β1. Sabiendo esto, se han desarrollado tratamientos para pacientes con quemaduras. En el caso de los hepatocitos, estos sólo se consiguen mantener diferenciados en cultivo en presencia de moléculas de la ECM. En ello está implicada la integrina α3, cuya alteración previene la diferenciación vía colágeno I (componente de la matriz que detecta). En el caso de las células epiteliales mamarias, al ser cultivadas en soporte de plástico, no expresan genes específicos de las mamas, de su tipo celular, pero en medio EHS forman estructuras alveolares, se da una diferenciación fenotípica completa e incluso la activación de genes que codifican para la producción de leche. El medio EHS contiene laminina y es la integrina β1 la que mantiene el estado diferenciado de la célula.

2.4. Apoptosis En embriogénesis de vertebrados superiores es la vía para la remodelación de tejidos. Durante el desarrollo de la glándula mamaria, por ejemplo, las moléculas de la lámina basal suprimen la apoptosis de las células epiteliales. Tras la época de lactancia, los numerosos alvéolos que se producen para formar leche se degradan y reabsorben. Esto ocurre a causa de la degradación enzimática de la lámina basal: la degradación de la matriz y represión de la integrina β1 y la quinasa FAK, dan lugar a la activación de la caspasa-1 que, a su vez, induce la apoptosis.

3. Cura de heridas ¿Qué ocurre al hacerse una herida o un corte en la piel? En estas situaciones ocurren los siguientes procesos: - Se tapona la herida y se para la hemorragia, mediante la coagulación con plaquetas. - Las células endoteliales dañadas e incluso las adyacentes liberan citoquinas y otros factores de crecimiento, cuya función es reclutar células del sistema inmune. - Se produce la inflamación. - Se forma una red de fibrina para compactar el coagulo, estimular la proliferación celular de las células endoteliales y queratinocitos (células epiteliales en general). - Hay migración de las células. - Se genera y se forma el colágeno. - Se eliminan las células muertas y las que han intervenido y ya no hacen falta.

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En la Figura 6 se muestra un esquema temporal de la aparición en orden cronológico de los principales participantes, tanto celulares como moleculares, en la cura de una herida superficial. Aunque en este caso solo se tarden 21 días, hay que tener en cuenta que solo se trata de una sucesión de etapas dadas con unas características concretas y que el proceso total puede durar más o menos. En una primera fase se frena la hemorragia y se produce fibrina para formar la costra donde leucocitos y plaquetas se podrán adherir. Los macrófagos aparecerán más tarde, provocando la inflamación, seguidos de los linfocitos. Posteriormente, se induce la regeneración a partir de la proliferación de queratinocitos, también comienzan la angiogénesis y granulación, reformando colágeno y epitelio. El colágeno sustituye a la fibrina y hace de base para que las células se adhieran.

Figura 6. Sucesión cronológica de actores que forman parte del proceso de cura de una herida superficial.

Hay veces en que el daño llega a gran profundidad, superando la epidermis y la dermis, llegando hasta la hipodermis, donde se encuentran células adiposas y vasos sanguíneos. Las células del sistema inmune, de los vasos sanguíneos, de la epidermis, etc. todas ellas liberan factores de crecimiento para movilizar las células hacia la cicatrización. Entre ellos están los TGF (entre los que destaca el TGF-β), unos mitógenos de macrófagos: estimulan la síntesis de procolágeno y fibronectina y son eficaces acelerando la curación en general. También están los VEGF, secretados por queratinocitos y macrófagos, que inducen la vascularización; y los PDGF, secretados por plaquetas y macrófagos, que son unos mitógenos de fibroblastos, eficaces acelerando la regeneración. Estos últimos se utilizan en un producto comercial llamado REGRANEX® Gel, el cual tiene una actividad biológica similar a la natural y añade señales al lugar de la herida para que las células adyacentes aceleren el proceso de regeneración y formación de tejido de granulación. Existen otros productos comerciales para la cura de heridas que aplican estos conocimientos, como por ejemplo el INTEGRA® Dermal Regeneration Template, que contiene condroitín-6sulfato, un componente de la ECM que actúa como señal para la regeneración de la piel dañada, y provoca la formación de nueva piel. Este producto añade componentes de la ECM como colágeno o glucosaminoglicanos que ayudan a esta regeneración. Al igual que el producto anterior, este producto no corresponde a un constructo típico con scaffold. En cambio, el OASIS® Wound Matrix es una matriz acelular para regeneración, que sirve tanto para heridas superficiales como para heridas más profundas que alcanzan la hipodermis.

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