Tema 3 Fotoluminiscencia PDF

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Tema 3. FOTOLUMINISCENCIA MOLECULAR 3.1 Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia. 3.1.1 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia. - Espín del electrón. - Estados excitados sencillo/triple. - Diagramas de nivel de energía para las moléculas fotoluminiscentes. 3.1.2 Velocidades de absorción y de emisión. 3.1.3 Procesos de desactivación. - Relajación vibracional - Conversión interna - Conversión externa - Cruce entre sistemas - Fosforescencia 3.1.4 Variables que afectan a la fluorescencia y la fosforescencia. - Rendimiento cuántico. - Tipos de transiciones en fluorescencia. - Eficacia cuántica y tipo de transición. - Fluorescencia y estructura. - Efecto de la rigidez estructural. - Efectos de la temperatura y del solvente. - Efecto del pH en la fluorescencia. - Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia. - Supresión dinámica. - Otros tipos de supresión. 3.1.5 Espectros de emisión y excitación. 3.2 Instrumentos para la medida de la fluorescencia y de la fosforescencia. 3.2.1 Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorómetros. - Fuentes - Filtros y monocromadores - Transductores - Celdas y compartimientos para las celdas - Organización de la información. 3.2.2 Diseños de instrumentos - Fluorómetros - Espectrofluorómetros - Espectrofluorómetros provistos con detectores en serie - Sensores de fluorescencia de fibra óptica - Fosforímetros 3.2.3 Esquemas de corrección y compensación. - Compensación de la fuente - Espectros de excitación corregidos - Espectros de emisión corregidos 3.2.4 Calibración del instrumento. 3.3 Aplicaciones y métodos fotoluminiscentes. 3.3.1 Determinación fluorométrica de especies inorgánicas - Cationes que forman quelatos fluorescentes - Reactivos fluorométricos 3.3.2 Métodos para especies orgánicas y bioquímicas 3.3.3 Métodos fosforimétricos 3.3.4 Detección de fluorescencia en cromatografía líquida 3.3.5 Medición del tiempo de vida 1

3.3.6 Métodos de imágenes por fluorescencia 3.4 Quimioluminiscencia. 3.4.1 El fenómeno de la quimioluminiscencia 3.4.2 Medición de la quimioluminiscencia 3.4.3 Aplicaciones analíticas de la quimioluminiscencia - Análisis de gases - Análisis de especies inorgánicas en fase líquida - Determinaciones de especies orgánicas Procedimientos luminiscentes moleculares, tienen tres tipos de métodos ópticos fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia moleculares. En todos ellos, las moléculas del analito se excitan para generar una especie cuyo espectro de emisión suministra información para el análisis cualitativo y cuantitativo. Fotoluminiscencia engloba la fluorescencia y fosforescencia. La excitación se consigue mediante la absorción de fotones. -Fluorescencia, no cambia el espín del electrón, por eso presenta vida corta el estado excitado (‹10-5 s). Se excitan con una fuente de E externa (electricidad, luz..) y emiten las radiación. Traje reflectante, se le da luz, este emite fluorescencia, si quitamos la luz, deja de emitir. - Fosforescencia, si cambia el espín, presentan vida más larga de segundos a minutos. Se incide E en la sustancia, esta se excita y tarda más en relajarse, un proceso gradual por eso al quitar la fuente de E, sigue emitiendo fosforescencia. La fotoluminiscencia, tanto si es de fluorescencia como de fosforescencia, se presenta a longitudes de onda más largas que las de la radiación que se utiliza para la excitación. Quimioluminiscencia se basa en la radiación que emite una especie excitada que se forma en el curso de una reacción química. Ej. Reacción del analito con un oxidante fuerte (O3 o H2O2) El resultado es el espectro de emisión característico del producto de oxidación del analito o del reactivo, en lugar del espectro del analito. Ventajas del método: sensibilidad, amplios intervalos de linealidad. Desventajas: estados excitados son muy susceptibles de ser inactivados por colisiones u otros procesos, muchas moléculas no manifiestan fluorescencia o fosforescencia. Por esta razón, las mediciones de luminiscencia se combinan con técnicas de separación como cromatografía y electroforesis. Se usan más en análisis cualitativo que en cuantitativo.

3.1 Teoría de la fluorescencia y la fosforescencia. La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos gaseosos, líquidos y sólidos, tanto sencillos como complejos. Radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia, tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida se vuelve a emitir sin cambio de frecuencia. (misma λ al absorber y emitir).

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Desplazamiento Stokes, es un desplazamiento hacia longitudes de onda más largas, o menores energías. Absorben una λ y presentan bandas de fluorescencia emitidas con otra λ más larga.

3.1.1 Estados excitados que producen fluorescencia y fosforescencia. Veamos la diferencia entre fluorescencia y fosforescencia, según el espín del electrón y las diferencias entre los estados excitados sencillo/triple.

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Espín del electrón.

El principio de exclusión de Pauli establece que o haya más de dos electrones en un orbital y, además, el espín de cada uno debe ser opuesto al del otro, “espines apareados o emparejados”. Debido al emparejamiento de los espines, la mayoría de las moléculas no presenta un campo magnético neto, por eso se dice que son diamagnéticas, es decir, no son atraídas ni repelidas por campos magnéticos estáticos. Por el contrario, los radicales libres, que contienen electrones desemparejados, poseen un momento magnético y, por consiguiente, los atrae un campo magnético. Por eso se dice que los radicales libres son paramagnéticos.

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Estados excitados sencillo/triple.

Estado sencillo, todos los espines de los electrones están emparejados. cuando la molécula se expone a un campo magnético no se produce una división de niveles energéticos. Estado doble, estado fundamental de un radical libre. Hay dos orientaciones posibles que puede tomar el electrón impar en un campo magnético, lo cual proporciona ligeras diferencias de energía al sistema. Estado sencillo o triple, cuando uno de un par de electrones de una molécula es excitado y pasa a un nivel de energía superior. -

-

En el estado sencillo excitado, el espín del electrón promocionado continúa emparejado con el electrón del estado fundamental. En el estado triple, los espines de los dos electrones ya no forman una pareja y, por tanto, son paralelos, es decir, tienen la misma dirección.

Entre ambos hay diferencias:

-

El estado triple excitado es menos energético que estado sencillo excitado. Sus propiedades difieren, como una molécula es paramagnética en el estado triple y diamagnética en el sencillo.

Es menos probable pasar de sencillo a triple, que de sencillo a sencillo.

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Diagramas de nivel fotoluminiscentes.

de

energía

para

las

moléculas

Diagrama de Jablonski

La línea horizontal gruesa que se encuentra en la parte inferior de la figura representa la energía del estado fundamental de la molécula, que normalmente está en estado sencillo y se designa S0. A temperatura ambiente, este estado representa la energía de la mayor parte de las moléculas en una solución. Las líneas gruesas superiores son los niveles de energía de los estados vibracionales fundamentales de tres estados electrónicos excitados. Las dos líneas situadas a la izquierda representan los estados electrónicos sencillo primero ( S1) y segundo ( S2). La línea de la derecha ( T1) representa la energía del primer estado electrónico 4

triple. Como suele ocurrir, la energía del primer estado triple excitado es menor que la energía del correspondiente estado sencillo. Las rectas horizontales finas están asociadas a numerosos niveles de energía vibracionales. Las transiciones de absorción ocurren desde S0 a S1 y S2. No se muestra la excitación directa hacia el estado triple. Puesto que en esta transición hay un cambio en la multiplicidad, tiene una baja probabilidad de suceder. “transición prohibida”. Relajación vibracional = proceso en el que no hay radiación, las moléculas excitadas que van hacia los estados electrónicos S1 y S2 pierden con rapidez el exceso de energía vibracional y se relajan, con lo que adquieren el nivel vibracional fundamental de ese estado electrónico. (En resumen, del estado fundamental se excitan con una fuente de E. los electrones, y pasan a un nivel superior (estados sencillos excitados) con un espín opuesto, cuando tienden a volver al estado fundamental (bajan otra vez) y liberan energía, en forma de luz fluorescente. Si se quita la fuente, ya no emite más luz.) (Si del estado excitado sencillo, pasa al estado excitado triple (no viene directamente del fundamental) se llama “cruce de sistemas” y cambia el espín del electrón emitiendo energía en forma de luz fosforescente, que no se extingue tan rápido, así que si se retira la fuente, sigue emitiendo la luz hasta que se extinga)

3.1.2 Velocidades de absorción y de emisión. La velocidad a la cual se absorbe un fotón de radiación es enorme, y su valor es del orden de 10-14 a 10-15 s. Por otro lado, la emisión fluorescente tiene lugar a una velocidad significativamente más baja 10-5 a 10-10 s. Para que haya emisión fosforescente se requieren tiempos comprendidos entre 10-4 y 10 s o más.

3.1.3 Procesos de desactivación. Una molécula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una combinación de varias etapas mecánicas, dos de estas etapas, fluorescencia y fosforescencia, requieren la emisión de un fotón de radiación. (flechas arriba). Las otras dos etapas de desactivación (flechas onduladas) son procesos no radiantes. Lo mejor es pasar al estado fundamental en menos tiempo de vida, luego la desactivación por fluorescencia es más rápida que los procesos no radiantes, se observa tal emisión. Pero si una trayectoria no radiante tiene una constante de velocidad más favorable, no hay fluorescencia o es menos intensa.

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Relajación vibracional

Las colisiones entre moléculas de las especies excitadas y las del solvente ocasionan una transferencia de energía rápida y un incremento minúsculo de la temperatura del solvente. La relajación vibracional es tan eficaz que el tiempo de vida medio de una molécula excitada en forma vibracional es 10-12 s o menos, un periodo más corto que el tiempo de vida medio de un estado excitado con medios electrónicos. Como consecuencia, la fluorescencia de una solución siempre involucra una transición desde el nivel vibracional más bajo de un estado electrónico excitado. Sin embargo, se producen varias líneas de emisión muy próximas, y la transición puede finalizar en cualquiera de los niveles vibracionales del estado fundamental.

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Conversión interna

Cuando la molécula pasa a un estado electrónico de más baja energía sin emitir radiación. La conversión interna es un cruce entre dos estados de la misma multiplicidad (sencillo-sencillo o triple-triple). Ocurre cuando los dos niveles de E están muy próximos. Puede verse esta conversión entre el estado S1 y el S0. En el diagrama, la banda de radiación (la fuente) λ2 produce una banda de fluorescencia con λ3 la molécula excitada pasa del estado electrónico superior al estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado más bajo mediante una serie de relajaciones vibracionales, una conversión interna y relajaciones posteriores. En estas circunstancias, la fluorescencia tiene lugar sólo en λ3 sin importar que las radiaciones de longitud de onda λ1 o λ2 sean las responsables de la excitación. Ej. Quinina posee dos bandas de excitación a 250 nm y a 350 nm. Sin

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importar qué longitud de onda se utilice para excitar la molécula, la longitud de onda del máximo de emisión es 450 nm

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Conversión externa

Conversión externa= La desactivación de un estado electrónico excitado puede comprender la interacción y la transferencia de energía entre la molécula excitada y el solvente u otros solutos. Puede verse en efecto que ejerce el solvente en la intensidad de la fluorescencia. Además, aquellas condiciones que tienden a reducir la cantidad de colisiones entre partículas (baja temperatura y elevada viscosidad) tienden por lo general a aumentar la fluorescencia.

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Cruce entre sistemas

El cruce entre sistemas es un proceso en el cual hay un cruce entre estados electrónicos de multiplicidad distinta. El proceso más común es del estado sencillo al estado triple (S1 → T1). Aumenta la probabilidad si los dos sistemas se superponen. Las interacciones espín-orbital aumentan en presencia átomos pesados (Br o I) favoreciendo un cambio en el espín. La presencia de especies paramagnéticas, como el oxígeno molecular, en la solución también favorece el cruce entre sistemas y, por consiguiente, disminuye la fluorescencia.

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Fosforescencia

La desactivación de estados electrónicos excitados también puede ser causada por la fosforescencia. Después del cruce entre sistemas para lograr un estado triple excitado, la desactivación posterior puede tener lugar por conversión interna o externa o por fosforescencia. Una transición triple S sencilla es mucho menos probable que una conversión sencillasencilla. El tiempo de vida promedio de un estado triple excitado respecto a la emisión es grande, de ahí la fosforescencia. Se retira la fuente y sigue emitiendo luz. Las conversiones externas e internas compiten con tanto éxito con la fosforescencia que este tipo de emisión se observa en forma común sólo a temperaturas bajas en medios altamente viscosos o al aplicar técnicas especiales para proteger el estado triple.

3.1.4 Variables que afectan a la fluorescencia y la fosforescencia. Tanto la estructura molecular como el entorno químico determinan que una sustancia sea o no luminiscente. Estos factores también determinan la intensidad de emisión cuando tiene lugar la luminiscencia.

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Rendimiento cuántico.

El rendimiento cuántico o la eficacia cuántica de la fluorescencia o la fosforescencia es simplemente la relación entre la cantidad de moléculas que manifiestan luminiscencia y el número total de moléculas excitadas. Las sustancias muy fluorescentes se aproximan a 1 y las menos a 0. El rendimiento fluorescencia ф

cuántico de un compuesto

de se

puede calcular a partir de las constantes de velocidad relativas kx para los procesos por los cuales queda inactivo el estado sencillo excitado más bajo. Estos procesos son fluorescencia (kf), cruce entre sistemas (ki), conversión externa (kec), conversión interna (kic), predisociación (kpd), y disociación (kd). Aquellas variables que originan valores altos para la constante de velocidad de la fluorescencia kf y valores bajos para los otros términos kx intensifican la fluorescencia.

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Tipos de transiciones en fluorescencia.

La fluorescencia rara vez absorbe por debajo de 250 nm en UV, puesto que esa radiación es suficiente energética desactivando los estados excitados por predisociación o disociación. Rara vez se observa fluorescencia debida a transiciones σ* → σ (σ* es estado excitado) con enlaces simples. Pero si se ve fluorescencia en radiaciones menos energéticas con transiciones en enlaces múltiples ϖ* → ϖ o ϖ* → n (n= electrones no enlazantes).

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Eficacia cuántica y tipo de transición.

La eficacia cuántica es mayor (más frecuente) con la transición electrónica del tipo ϖ* → ϖ que del tipo ϖ* → n. Pues su absortividad es 100-1000 veces superior, y su tiempo de vida es más corto. la fosforescencia más eficaz ocurre a partir del estado excitado n, ϖ* el cual tiende a ser más corto en cuanto a vida y, por tanto, menos susceptible a la desactivación que un estado triple ϖ, ϖ*. El cruce entre sistemas es menos probable para estados excitados ϖ, ϖ* que para estados n, ϖ* porque la diferencia en energía entre los estados sencillo y triple es mayor y el acoplamiento espín-órbita es menos probable.

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Fluorescencia y estructura.

La fluorescencia más intensa y la más útil es la de los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones ϖ → ϖ* de baja energía. Los compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o estructuras con dobles enlaces altamente conjugados también presentan fluorescencia (hay menos). La eficacia cuántica aumenta de ordinario en relación con la cantidad de anillos y con su grado de condensación. Los heterocíclicos sencillos, como la piridina, el furano, el tiofeno y el pirrol, no presentan fluorescencia.

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En los heterocíclicos con nitrógeno, se supone que la transición electrónica de más baja energía requiere un sistema n → ϖ* que rápidamente se transforma en un estado triple e impide la fluorescencia. La condensación de anillos bencénicos para dar núcleos heterocíclicos da como resultado un aumento en la absortividad molar ε de la banda de absorción y el tiempo de vida del estado excitado es más corto. La fluorescencia se observa en compuestos como:

La sustitución en el anillo bencénico provoca desplazamientos en la longitud de onda de los máximos de absorción y cambios correspondientes en la emisión de fluorescencia. La disminución de la fluorescencia con el aumento de la masa molar del halógeno el cual aumenta la probabilidad para el cruce entre sistemas hacia el estado triple.

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Efecto de la rigidez estructural.

La fluorescencia se ve favorecida sobre todo en moléculas que poseen estructuras rígidas. El fluoreno tiene mayor eficacia cuántica. En agentes quelantes orgánicos cuando forman un compuesto con un ion metálico aumenta la fluorescencia también, puyes es una estructura más rígida.

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Efectos de la temperatura y del solvente.

Al aumentar temperatura, aumentan colisiones y hay más probabilidad de desactivación por conversión externa, luego disminuye la fluorescencia. También ocurre con la disminución de la viscosidad. La fluorescencia disminuye en solventes con átomos pesados. Si se quiere resaltar la fosforescencia se incorporan átomos pesados.

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Efecto del pH en la fluorescencia.

La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende del pH. Es probable que tanto la longitud de onda como la intensidad de emisión sean diferentes en las formas protonados y no protonados del compuesto.

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Si tiene formas resonantes ocasionan un primero estado excitado más estable consecuencia es una fluorescencia en la región ultravioleta.

la

La fluorescencia de ciertos compuestos en función del pH se ha utilizado para detectar puntos finales en titulaciones ácido-base. La constenate de disociación de estado excitado difiere del fundamental.

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Efecto de la concentración en la intensidad de fluorescencia.

La potencia de la emisión fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación absorbido por el sistema. P0= la potencia del haz que incide sobre la solución. P=su potencia después longitud b del medio

de

atravesar

una

фf = la eficacia cuántica del proceso de fluorescencia

La eficacia cuántica de la fluorescencia es una constante de un sistema luego фfK” se agrupa en K´. Relacionamos F con la concentración c de la especie fluorescente, la ley de Beer: Sustituimos en la anterior: El término exponencial puede desarrollarse en serie McLaurin:

Siempre que 2.303εbc = A < 0.05, todos los términos posteriores entre corchetes son pequeños respecto al primero término. Y daría En una gráfica F con c es lineal a bajas concentraciones, pero si c es elevada y A>0.05, entonces pierde linealidad “absorción primaria”. “Absorción secundaria o autoabsorción” la λ...