TEMA 4 - APUNTES PDF

Preview

Summary

APUNTES...

Description

TEMA 4 ELECTROFORESIS Qué es Electroforesis Movimiento de (bio)moléculas en disolución al aplicar un campo eléctrico. Las (bio)moléculas se mueven con distinta velocidad, en función de su carga y forma (tamaño molecular). Cuanto mayor carga más se mueven y en contra del movimiento va el tamaño. Mayor carga/masa más movilidad electroforética. En general, para moléculas pequeñas no se usa electroforesis exceptuando electroforesis capilar. Se usa para el análisis y purificación de moléculas muy grandes (proteínas, ácidos nucleicos) y para el análisis de moléculas sencillas cargadas (azúcares, aminoácidos, péptidos, nucleótidos e iones sencillos). Los HC no!! Porque no migran bien porque no van a adquirir carga. Mecanismo de electroforesis • Cuando las moléculas cargadas se encuentran en un campo eléctrico, migran tanto hacia el polo positivo (ánodo) como al negativo (cátodo) dependiendo de su carga. Los factores que influyen en la movilidad electroforética: 1. Carga total de la molécula 2. Forma y tamaño 3. Concentración: puede interferir porque a veces no sean suficientes las cargas para poder separar mi molécula.

Electroforesis en una superficie fina (membrana o gel) La disolución con los analitos de la muestra se encuentra “inmovilizada” en un soporte hidrofílico sólido. Matriz sólida porosa: Papel, Almidón, Acetato de celulosa, Poliacrilamida, Agar/agarosa (los 3 últimos los más utilizados). Moléculas de la muestra se mueven a través de la matriz porosa a distinta velocidad. Electroforesis en una o dos dimensiones (1D, 2D) • 1D: La mayor parte de las separaciones de rutina de proteínas y ácidos nucleicos • 2D: Separaciones analíticas de proteínas. Para la obtención de “huellas digitales” (fingerprints) en función del número (varios miles) y abundancia relativa - Proteómica. Los diferentes puntos de la gráfica salen en ortogonal (diagonal porque primero se separa en función del tamaño y luego del peso…por ejemplo). Los medios más empleados son la poliacrilamida y la agarosa. Tampones -Función del tampón: 1. Transmite la corriente aplicada 2. Mantiene el pH 3. Determina la carga de los solutos -Tampones de alta fuerza iónica: 1. Produce bandas más estrechas 2. Produce más calor • Tampones usados frecuentemente 1. Barbital & Tris-EDTA para proteínas 2. Tris-acetato-EDTA & Tris-borato-EDTA (50 mM; pH 7.5- 7.8) Electroforesis en zona (zonal) Aplicamos la muestra en un punto y la moleccula puede ir a los dos lados, al positivo o al negativo. Dejamos que la molécula se mueva en función de su carga intrínseca. Para separar proteínas del plasma (globulinas) “tiras” de acetato de celulosa: determinación clínica, rápida para ver la distribución de proteínas. Es la más sencilla, tiene una gran resolución, muestras pequeñas. La separación de proteínas depende del tipo y número de cadenas laterales de aminoácidos (R) y del tamaño de la carga neta (positiva o negativa). Las proteínas cargadas negativamente se mueven hacia el ánodo y las proteínas cargadas positivamente se mueven hacia el cátodo..

Electroforesis en zona “Tira” de acetato de celulosa Electroforesis Las principales proteínas se separan en zonas discretas (bandas) La intensidad de las bandas (densitometría) es proporcional a la abundacia de la proteína Aplicación de la electroforesis en la práctica clínica

Electroforesis en gel Un gel es un coloide semisólido (99% es agua). El material del gel actúa como un “tamiz molecular”. ¡¡Acetato de celulosa: electroforesis libre!! Ahora sí interacciona porque se dificulta el avance de proteínas. Durante la electroforesis, las macromoléculas se ven obligadas a moverse a través de los poros debido a la corriente eléctrica Medio de soporte: Los geles de agarosa y poliacrilamida constituyen estructuras entrecruzadas similares a esponjas. Importante que el soporte sea eléctricamente neutro. Cargas en el soporte suponen: 1. Retraso en la migración 2. Flujo de disolvente (cargas) hacia uno u otro de los electrodos 3. Flujo electro(endo)osmótico que disminuye la resolución. MEDIOS DE SOPORTE: -

-

Agarosa: Polisacárido muy purificado obtenido a partir de agar obtenido de algas. Largas cadenas de polímero que se sostienen mediante enlaces de hidrógeno y fuerzas hidrofóbicas. Acrilamida: (CH2=CH-CO-NH2 )

-

Poliacrilamida: estructura de gel constituida a base de entrecruzamientos covalentes.

-

Geles de agarosa: Para la separación de 1) grandes proteínas o complejos proteicos 2) polinucleótidos de 50-30000 pares de bases (tanto ADN como ARN). El tamaño del poro se determina ajustando la concentración de agarosa en el gel (normalmente de 0.4-4%). No se aguanta en vertical, solo en horizontal.

Soporte para geles de agarosa: Electroforesis en agarosa de DNA con bromuro de etidio iluminado con luz UV (diapo 16): El DNA no se ve porque este es transparente. Añadimos a la disolución bromuro de etidio que como tiene enlaces conjugados y planos se intercala entre las bases nitrogenadas, interacciona con la luz UV y nos da fluorescencia. De esta manera podemos ver donde están mis bandas. ¡ES CANCERÍGENO! Southern Blot:

Separación de ADN, separa secuencias específicas. 1. Digestión 2. Cargar electroforesis 3. Se coloca una membrana de nitrocelulosa en contacto con el gel y se promueve la adsorción de los ácidos nucleicos por una concentración salina. 4. DNA transferido 5. La membrana de nitrocelulosa se mete en una bolsa en la que hay una disolución con una sonda que se une a la secuencia complementaria. Esa secuencia lleva marcaje (fluorocromo, isotopo radioactivo). 6. Sistema de detección: Sólo aparecen bandas de la secuencia que quiero.

Northern blot: Para ARN

Western blot: Para proteínas

Geles de poliacrilamida: Los poros se generan cuando añades la poliacrilamida. El persulfato amónico genera sulfatos que catalizan la reacción pero estos sulfatos son inestables por lo que se usa TEMED. El tamaño de poro lo determina la acrilamida. La más común es la SDS-PAGE (si no hay poliacrilamida, no hay separación, no matriz) •

SDS-PAGE

SDS (laurilsulfato sódico): detergente aniónico. Las moléculas en disolución con SDS tienen carga negativa en un amplio rango de pH. Un polipéptido se une a SDS en una proporción constante: la cantidad es proporcional a la masa molecular relativa (1.4g enmascara 1g de proteínas). Se unen por la cadena hidrocarbonada. SDS destruye la estructura secundaria y confiere carga negativa: todas las proteínas se mueven hacia el ánodo con la misma relación carga/masa Ensamblaje vertical de electroforesis en gel de poliacrilamida: necesita dos soportes

SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie: 1. Muestra más tampón de carga ( glicerol que da densidad y colorante: marca frente a electroforesis) 2. Separación de proteínas electroforesis 3. Teñir proteínas: Reactivo más afín a proteínas que al gel, así teñimos. El azul de cromassie es el más usado en proteínas. 4. Densitometría por carril: En la foto se ve en el carril uno 3 proteínas y 3 picos,… Todas migran con la misma carga por lo que si se separa depende del tamaño. El orden de migración dependerá de su tamaño molecular. Para ello, usamos un patrón de proteínas de peso molecular conocido. Determinación de Masa molecular:

Western blot: Para detectar (cuantificar) una proteína en una mezcla. 1. Tras la separación mediante SDS-PAGE. 2. Transferencia a membrana de nitrocelulosa – el mismo patrón de separación (no con sales si no que se usa una transferencia de potencial). 3. Se añade un anticuerpo específico (incubar) contra la proteína de interés. 4. Se incuba con un anticuerpo secundario anti-anticuerpo, “marcado” (enzimático, radiactivo, cromóforo, fluoróforo). 5. Revelado: mediante una reacción o imagen directa – densitometría Dibuja presencia de GADPH en tejidos por western. En el 6 poco y el 8 tiene mucha importancia GADPH. Esta indica la importancia de GADPH en cada uno de esos tejidos (glucolisis).

Western y Southern nos d análisis semicuantitativo. Puedo comparar la expresión pero no es cuantitativo del todo porque no nos dice la cantidad. Para cuantificar necesitams que sea más específico (purificación Elisas…) Isoelectroenfoque: Muy aplicada en proteínas: electroforesis en 2D. Uso: herramienta analítica y herramienta complementaria para la separación de proteínas. Primero mezcla de anfolitos ( ácidos oligoaminados oligocarboxílicos de 600-900 Da, RNH-(CH2 )n -N-(CH2 )n - COOH • R=H, -CH2COOH, CH2 -N-R2R2) y se aplica una diferencia de potencial que establece un gradiente de pH. Cuando alcanzan los anfolitos su punto isoeléctrico (carga neta = 0)se paran = gradiente 39, aunque depende porque puedes comprarlo con diferente gradiente. Misma longitud y menos rango de pH = mejor separación entre pH muy parecidos 4.5-4.6. Geles con mayor tamaño de poro, no se separan por peso molecular, solo por pH. Soporte ácido, con grupo amina y acidos (bajo patente, no sabemos su composición)

Principal aplicación: Electroforesis en 2D , primero un isoelectroenfoque se separa por punto isoeléctrico de la proteína. Después se gira la columna (todas las proteínas con el mismo punto isoeléctrico quedan en cada carril, pero ojo! Aquí solo analizas una muestra… exhaustivamente pero solo una), se separan las proteínas en un gel de SDS-PAGE (electroforesis) por el PM. Se separan proteínas por punto isoeléctrico y por peso molecular y se obtiene un mapa de puntos. Mapeado proteico:

Si establecemos mismas condiciones con la misma muestra podemos intentar identificar la proteína. ¿Cómo identificarlos? Proteómica: información de las proteínas de la muestra y de los cambios que puede haber en dos situaciones diferentes (normal y patológica). Nos puede servir para estudiar situaciones complejas o para establecer biomarcadores. Para ello, la muestra se debe analizar en las mismas condiciones -

Geles control y geles patológicos. Se pueden comparar la expresión de determinadas proteínas en dos situaciones diferentes (alta intensidad de mancha, más expresión. Se marcan en rojo por ejemplo y las que tienen menos expresión en otro color. Así visualizas mejor los puntos en los que hay diferencia.

¿Cómo identificar estas diferencias? 1. 2. 3. 4. 5.

Cortar región del gel donde hay diferencias. Sacamos una pequeña cantidad de proteínas Se digiere con tripsina Análisis de péptidos por espectofotometría de mesas Contrastar con BBD y así poder identificar la proteína que está en nuestra muestra (UNIPROT)

Sólo podemos identificar proteínas ya descubiertas (que estén en las BBDD). Nueva proteína: Aislarla, purificarla (en cantidad necesaria para poder indentificarla), secuenciación (cuesta mucho trabajo). Proteómica se basa en proteínas ya descubiertas. En la actualidad se tiende a no hacer electroforesis en gel, y en vez de hacer la digestión de la proteína del gel se extraen de los tejidos. Se digieren directamente y se purifica. Va a depender de la que queramos, por ejemplo columna que une solo péptidos fosforilados y asi purificarlos. Después mediante cromatografía de líquidos acomplada a un espectofotometro de masas derterminar la identidad de la proteína.Lo normal es usar electroforesis en gel para una separación más básica. Hoy en día se usa la anterior. 2D-PAGE Y ESPECTROMETRíA DE MASAS – PARADIGMA EN PROTEÓMICA:

Avances en proteómica y MS

Secuenciación de péptidos mediante la Degradación de Edman Se usa un reactivo que se une al N-terminal (FENILISOCIANATO) y por espectofotometria de masas podemos determinar que aminoácidos es el que está en el N-terminal y así podemos determinar todos los aminoácidos de la proteína. Limitación: solo se pueden degradar proteínas con menos de 50 aa’s Electroforesis capilar (CE) La separación se basa en los mismos principios que la electroforesis en gel (movimiento en un campo eléctrico) pero los compuestos se separan en el interior de tubos capilares (50 µm D.I.) de 50-100 cm. Herramienta analítica (no con criterio preparativo porque los volúmenes de inyección de muestra son muy pequeños (nanolitros)). Gran aumento en eficacia y resolución porque se pueden separar compuestos muy similares entre si, por ejemplo: leucina e isoleucina. También porque las bandas son muy estrechas (alta sensibilidad). Detección en línea, se pueden acoplar diferentes detectores por lo que nos da un análisis CUANTITAVO (como cromatografía, en electroforesis no). Poco empleada, pero si se usa para el análisis de moléculas (proteínas, péptidos, aa, ácidos nucleicos, iones orgánicos…). Es muy buena técnica para separar compuestos quirales (enantiómeros) , para ver que explosivo se ha usado en un atentado. VENTAJAS: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Instrumentación sencilla: Sólo necesitamos electrodos Analisis de muestras acuosas (más sencilla) Elevadas eficacias de separación Pequeños volúmenes da muestra (orina ratón, plasma…) Automatización Rapidez de análisis (hay cromatografías más rápidas como cromatografía de líquidos pero es más rápida que cromatografía en gel). Si se combina con cromatografía de líquidos, alta selectividad. Cuantificación lineal Se puede acoplar a espectofotometría de masas Bajo coste

INCONVENIENTES: 1. Preparativo 2. Sensibilidad comprometida por bajo volumen de muestra. 3. Solubilidad no universal (por la diferencia de potencial)

4. Problemas de reproducibilidad de los tiempos de solido son muy diferentes, no como en cromatografía de líquidos ni mucho menos en cromatografía de gases que los tiempos de retención son casi iguales. Aplicaciones de CE • Moléculas: Proteínas, Péptidos, Aminoácidos, Ácidos nucleicos (bases, RNA y DNA), Iones inorgánicos, Bases orgánicas , Ácidos orgánicos, (Células enteras). • Bioquímica, Biotecnología, Química clínica, forense, de alimentos, Toxicología, Farmacia, farmacología, Enzimología, inmunología, Microbiología, Botánica, citología, Biología Molecular, etc Fundamentalmente para compuestos cargados positivamente aunque no es obligatorio que tengan carga positiva para analizarse por EC. Historia de CE • Arne Tiselius (1931) –Separación de proteínas –Premio Nobel de Química 1948 • Hjertén (1967) –Electroforesis en tubos de pequeños diámetro • Mikkers (1979) –Electroforesis en tubos de PTFE de 0.2 mm • Jorgenson y Lukacs (1981) –Electroforesis en microcapilares de sílice • Smith (1987) – CE-MS • PRIMER EQUIPO COMERCIAL DE CE (1989) Esquema de CE

Mecanismo básico de separación en electroforesis

El capilar se introduce en la muestra, se introduce por ambos lados en un tampón de separación y se le da una diferencia de potencial. Los compuestos positivos migran hacia el cátodo que es el polo negativo. Esto es lo mismo para la electroforesis en gel pero en esta no se tiene en cuenta la carga ya que se trata con SDS por lo que solo le afecta la resistencia que le ofrece el gel. Dentro del capilar: el zeta-potencial: La superficie interior del capilar está recubierta por grupos silanol (SiOH), desprotonados (SiO- ) a pH > 2. SiO-atrae a los cationes hacia la superficie. Se genera una capa difusa rica en cationes con movilidad (gradiente). La distribución de cargas se describe mediante el modelo de doble capa de Stern y da lugar al potencial zeta (ζ).

Flujo electroosmótico (FEO) – EOF Arrastra compuestos por flujo electrosmótico (FEO). El flujo neto es mayor cuanto mayor es el pH. Factores clave que influyen en la movilidad electroosmótica: la constante dieléctrica y la viscosidad del medio. EOF se puede amortiguar mediante la “protección” de los silanoles o a pH bajo. Movilidad Electroosmótica: Donde: v = movilidad electroosmótica o = constante dieléctrica del vacío  = constante dieléctrica del medio  = potencial Zeta  = viscosidad  E = campo eléctrico Electroforesis y Electroosmosis:

Se mueven compuestos por flujo electroforético y flujo electroosmótico.

Controlar el Flujo Electroosmótico:

DIFERENTES MODOS DE CE:

Electroforesis Capilar Zonal (CZE) Separar diferentes formas del antibiótico (alta capacidad separación). No es una aplicación fundamental pero si necesitamos separar cosas complejas podemos añadir un detergente como SDS (MERK= cromatografía micelar electrocinética). El detergente puede interaccionar y formar micelas (técnica para separar compuestos hidrófobos). Cromatografía micelar electrocinética (MEKC) MERK-quiral: micelas como ciclodextrina que puede separarnos compuestos quirales ya que en este clico solo entra una forma del enantiómero que migra por los diferentes fujos con la dextrina (la ciclodextrina es glucosa por lo que tiene coste bajo).

DETECTORES para CE UV: Casi universal, µM LOD, Más extendido. Posibilidades: Detección directa, Detección indirecta. Laser-induced Fluorescence: Muy sensible, Muy selectivo. MS: El mejor detector universal, Acoplamiento a MS difícil: ◦ voltaje/vacio ◦ con flujos de nL/min. Es difícil porque se necesita que entre un flujo constante. DETECCION INDIRECTA: Sustancia que absorbe mucho cuando salga disminuirá mucho la absorbancia. IDENTIFICACIÓN DE AAs EN ORINA HUMANA  MEDIANTE CE-LIF ELECTROFORESIS CAPILAR- ESPECTOFOTOMETRIA DE MASAS

Aplicaciones de CE: secuenciación de DNA Ejemplo: Separación de aminoácidos incluyendo incluso formas D-L de la orina humana. Se derivatiza con un reactivo. Aplicación estrella: secuenciación de DNA. Se añade fragmento de DNA y dNTs (dideoxiNT) que para la repliación. Entonces la polimerización en ese pocillo se detendrá en un determinado NT. Generan todos los NT complementarios a nuestra secuencia de síntesis  se ponen 4 eppendprf, los que terminan en T, en A, en C, en G… y al separarse el fragmento por electroforesis en el gel se ve la secuencia. Ahora se hace con EC se sigue poniendo dideoxi NT que además estan modificados con fluorescencia, cada NT(A,T,G,C) posee una fluorescencia diferente, entonces se separan todos los NT x EC y se obtiene un electrofotograma negro(G), azul(C) y se superponen los 4 y así sacamos la secuencia...