TEMA 4 genética - Apuntes 4 PDF

Preview

Summary

ana bonnin...

Description

TEMA 4: TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL mRNA Conceptos generales La RNA polimerasa es una holoenzima, formada por múltiples subunidades. -

Core: β, β`, α2, ω: Alta afinidad por el ADN, interacciones electroestáticas (proteína básica, ADN ácido) Factor sigma σ

La transcripción siempre es en dirección 5’ 3’ y es un proceso más lento que la replicación. La RNA polimerasa también es capaz de dar marcha atrás y eliminar nucleótidos erróneos, y después seguir con la transcripción. Hay veces que la RNA polimerasa toma pausas, incluso se detiene en algunos momentos. No todo el DNA se transcribe, y la RNA pol es la enzima encargada de la transcripción (no necesita iniciador). RNA pol promotor punto de partida +1 elongación terminación. Desde el nucleótido + 1, llamado TSS, se inicia la transcripción. Tenemos la región downstream y upstream, esta ultima está antes del inicio de la transcripción. Además, solo tenemos una cadena codificante. 

  

Promotor es el sitio donde la RNA polimerasa se une al DNA para iniciar la transcripción (NO es el sitio donde empieza la transcripción, sino donde se une). Start point o sitio +1 es la posición donde se incorpora los genes de la transcripción, es decir, se mete la primera base. Terminador es la secuencia que causa que la RNA polimerasa termine la transcripción. Unidad transcripcional incluye toda la secuencia del DNA que va entre el start point y el terminador. En el caso de las procariotas, los mRNA son policistrónicos (pueden codificar para más de una proteína, un mRNA policitistronico codifica para varios genes), con operones y proteínas para controlar la expresión

ESTRUCTURA DE LA RNA POLIMERASA Hay varias subunidades en la RNA polimerasa: alpha, beta, sigma y omega (además de alpha prima, beta prima). El magnesio es necesario para la actividad catalítica en el core del RNA. La RNA polimerasa tiene distintos canales: -

Un canal de acceso al DNA. Un canal por donde van a entrar los dinucleotidos (dNTPs). Otro canal por donde de sale el DNA. Un canal por donde sale el RNA.

1

Fases de la transcripción: Fase de iniciación, elongación y terminación. Iniciación: se produce el reconocimiento del promotor y de la burbuja de transcripción. Se forma: -

Un complejo abierto formado por RNA +DNA desenrollado. Un complejo cerrado formado por RNA + DNA doble cadena.

Elongación: movimiento de la burbuja de transcripción según se va dando la elongación y síntesis de ARN. Terminación: se acabará produciendo el cierre de la burbuja de transcripción y liberación de la polimerasa y molécula de ARN. *El factor sigma es muy importante, ya que la RNA polimerasa interacciona con el DNA gracias al factor sigma. Factores que modulan la actividad de la polimerasa: -

-

-

Factores químicos: moléculas que hacen que se estabilice o desestabilicen los complejos, la polimerasa, etc. Como la Guanosina 3´-5´ bifosfato (ppGpp): es sintetizada en respuesta a restricción de aminoácidos, como consecuencia, desestabiliza los complejos abiertos de genes relacionados con la traducción. Factores de transcripción. Disminuyen o aumentan la actividad de la polimerasa. Unen promotores y regulan la transcripción. Un factor de transcripción puede controlar múltiples genes o solo un gen. En E. Coli 7 factores de transcripción controlan el 50% de todos los genes y el 60% de los factores controlan solo un gen. Están sujetos a regulación por ligandos, expresión, degradación, etc… Pueden activar/reprimir. Reclutan y aumentan la afinidad de la polimerasa por sus promotores. Factor sigma: hace que interaccione la RNA pol con el DNA. La secuencia del DNA.

La polimerasa escanea el genoma en busca de promotores La RNA polimerasa va a escanear de manera aleatoria el genoma, este escaneo sirve para que la RNA pol salte en distintas regiones, asociándose y disociándose, hasta encontrar el sitio donde se une al factor sigma, reconoce el promotor y se inicia la transcripción. El factor sigma se libera una vez que se inicia la transcripción. Por lo que solo tiene función para el reconocimiento del promotor, pero no una vez que se ha iniciado la transcripción. -

-

La RNA Pol + el factor σ constituye la RNA polimerasa holoenzima. El factor σ proporciona especificidad a la unión de la RNA polimerasa y aumenta su afinidad por el promotor. El factor σ se libera al acabar el inicio de la transcripción.

2

Tipos de factores sigma Los tipos de factor sigma: son ejemplos, no hace falta aprendérselos. Hay distintos factores sigma que hacen que la RNA pol tenga una afinidad por distintos puntos. Los factores sigma se pueden regular: -

Transcripcionalmente Mediante factores anti-sigma: controlan localización, degradación o secuestro.

Resumen -

-

-

Un solo tipo de RNA polimerasa: en su estructura tiene distintas subunidades beta, alpha…, y se necesita un mg, tiene canales de entrada para el dna, dNTPs y canal de salida. Quien determina la especificidad de la RNA pol: algunas moléculas que son capaces de modular y estabilizar el complejo, como el factor sigma, la secuencia del DNA y los factores de transcripción. La RNA pol para reconocer los promotores escanea aleatoriamente el genoma y va a ser determinante el factor sigma y la secuencia del DNA para que se inicie la transcripción. Una vez que se inicie la transcripción el factor sigma se va. Hay distintos factores sigma (70 y 74…)

Estructura del promotor -

-

-

Secuencias downstream y upstream del sitio de inicio de la transcripción, encontramos el triplete + 1 con los nucleótidos CAT, en upstream tenemos secuencias reguladoras: TATA esta a -10 y TTGACA a -35. La interacción de la RNA polimerasa con la región del promotor es a través de las subunidades alpha que reconocen el elemento A, pero la secuencia TATA y TTGACA son reconocidas por el factor sigma. La polimerasa interacciona con el elemento A a través de sus dominios alpha. La RNA polimerasa interacciona con el promotor, con un sitio de inicio de la transcripción y secuencias a -10 y -35, luego el TGN (secuencia de guaninas repetidas un numero n de veces y reconocida por el factor sigma) y el elemento UP.

La RNA polimerasa exclusivamente interacciona con el elemento UP a través de sus dominios alfa.

3

ARN polimerasa y sus interacciones en los promotores. Las cadenas de ADN se muestran en verde, con los elementos -10 y -35 resaltados en amarillo y el TGN extendido -10 y los elementos UP resaltados en rojo. La ARN polimerasa se muestra con las subunidades β y β′ coloreadas en azul claro y rosa.

La región TGN y TATA, son reconocidas por el factor sigma y la RNA polimerasa interacciona con el elemento up y luego con el factor sigma. Una vez que el elemento sigma se une a la RNA polimerasa y reconoce el inicio de la transcripción, esta se inicia y tenemos distintas fases, un complejo binario (factor sigma y rna polimerasa) cerrado donde el dna no se ha desenrollado y no hay burbuja y un complejo abierto donde ya si hay burbuja de replicación. Y un complejo ternario (rna pol, factor sigma y un poco de rna) a partir del cual ya se inicia la transcripción y el factor sigma se libera. INICIACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN Una vez que el elemento sigma se ha unido a la rna polimerasa y ha reconocido el inicio de la transcripción esta va a iniciarse. Vamos a distinguir diferentes fases: -

-

-

Complejo binario cerrado. formado por factor sigma y la rna pol y no tenemos burbuja. Se abre la doble cadena empezando en las posiciones -11,+3. Se forma la burbuja de transcripción. Complejo binario abierto. Formado por factor sigma + RNA polimerasa, y aquí ya está formada la burbuja de transcripción, es decir, se ha abierto la doble cadena de dna para iniciar la transcripción. La polimerasa engloba la cadena simple de DNA en las posiciones -55, +20. La cadena simple pasa al canal activo. Se incorporan 2 nucleótidos. Complejo ternario: hay rna pol, factor sigma y una pequeña cantidad de rna que ya ha sido sintetizada. La polimerasa engloba la cadena simple de ADN en unas 35 bp. Liberación del factor sigma: Se inicia propiamente la transcripción y el factor sigma se libera. Comienza la iniciación abortiva

4

Iniciación abortiva Ya se ha iniciado la transcripción y llegamos a la FASE DE INICIACION ABORTIVA, que sirve para comprobar que la iniciación ha ido bien. La rna pol empieza a transcribir fragmentos de 3 a 8 nucleótidos, es una prueba, transcribe un poco y abandona un par de veces hasta que comprueba que va bien la transcripción. ES UNA FASE DE PRUEBA. No se transcribe todo el gen, proceso de prueba para ver que todo va bien antes de que el gen se transcriba del todo. ELONGACIÓN Y CORRECIÓN DE ERRORES *La rna pol es capaz de corregir errores, distinguir dNTPs (del DNA) y rNTPs (del RNA) ya que reconoce el extremo 2´OH de la ribosa. ACTIVIDAD CORRECTORA DEL ADN. Al detectar un error: El mRNA se despega ligeramente del template. Esto impide la extensión y entrada de nuevos nucleótidos. La polimerasa para y da marcha atrás una posición. Con su actividad nucleasa libera el nucleótido cortando y dejando un extremo 3´OH libre y permitiendo la entrada de un nuevo nucleótido. TERMINACIÓN -

Intrínseca

La rna polimerasa en la fase de terminación forma estructuras en horquilla tipo loops, que actúan como freno o pausa para la rna polimerasa. A esta terminación se la denomina terminación intrínseca, ya que es propia del rna que esta sintetizando. -

Extrínseca

Hay otro tipo de terminación, la TERMINACION EXTRINSECA, es la que viene determinada por el factor rho. Funciona de la siguiente manera: La rna pol sintetiza el rna, hay un factor que se denomina factor rho, que se une al rna y va a subir o trepar por el hasta llegar a donde se encuentra la polimerasa y una vez que llega a ella la va a desplazar, la aparta del dna en una reacción que consume energía.

Mecanismos de regulación de la transcripción: factores de transcripción. Los factores de transcripción, si aumentan la actividad son activadores, y si la disminuyen son represores. Hay distintos modelos: Activadores: - De clase I: El factor de transcripción interacciona con la polimerasa a través de la subunidad alfa. - De clase II: El factor de transcripción interacciona con el factor sigma. - De clase III: El factor de transcripción provoca un cambio conformacional que hace que el factor sigma se una al promotor.

5

Represores: - El represor compite con la rna polimerasa por la unión al promotor, de manera que la polimerasa ya no se puede unir. Puede provocar un cambio conformacional que impide que la rna polimerasa y el factor sigma accedan al promotor. También inhibe al activador y este ya no puede activar a la rna polimerasa. Los factores de transcripción de represión o activación pueden actuar individualmente (de forma simple, activación simple) o de forma cooperativa (codependencia), es decir, necesito un factor de activación 1, que active al 2 que active al 3… y ya a la rna polimerasa. Hasta que uno realiza la actividad. Necesito que dos factores de transcripción se unan para de verdad tener actividad. Actuación de los factores de transcripción: -

De manera individual (simple) De manera cooperativa. Se llama codependencia.

Una única rna polimerasa puede transcribir todos los RNAs, luego hay un procesamiento del rna, pero partimos de un rna único. Esto nunca va a ser así en eucariotas.

6

Inmunoprecipitacion de cromatina (CHIP) Sirve para: Detectar cualquier proteína unida a la cromatina. Consiste en el uso de un anticuerpo que reconoce la proteína y la concentro, es decir, la inmunoprecipito. Es la concentración de una proteína usando un anticuerpo. Un ejemplo es para detectar modificaciones de histonas (que son proteínas). Tenemos modificaciones en las histonas del dna, si queremos detectar estas modificaciones, usamos la inmunoprecipitacion contra esto. Se lisa la célula en un eppendorf, y dentro esta la proteína en estudio, uso un anticuerpo mono o policlonal que reconozca a la proteína en cuestión, el anticuerpo se une a la proteina y añado una resina que reconoce la región Fc del anticuerpo. La resina sirve para proporcionar peso, de tal manera que ahora en el eppendorf tengo la proteína unida al anticuerpo y a la resina, si centrifugo, al final del tubo tendré mi anticuerpo unido a la proteína y a la resina, luego se hacen lavados y finalmente se hará la elución, te quedas con la proteína, por un lado, el anticuerpo por otro y la resina por otro. Cuando se eluye, se añade SDS y luego 100º durante 5 minutos. Si quieres ver si tu proteína se encuentra fosforilada en la serina 2, y ya la has inmunoprecipitado, se hace un westtern blot, lo cargas en un gel, lo pasas a una membrana, y lo incubas con un anticuerpo antiserina 2. Tienes el dna y tienes la polimerasa, puedes inmunoprecipitar las histonas, la rna polimerasa, los factores de transcripción, los remodeladores de cromatina, de cualquier cosa que se una a la cromatina lo puedes inmunoprecipitar para aislarlo. Si quieres ver la cantidad de rna polimerasa que está unida a un gen haces una inmunoprecipitacion. 1. Fijas la célula en un proceso llamado crosslink: fijas las interacciones que hay en la célula, dejando todo pausado, las proteínas unidas al dna se quedan unidas a la cromatina, se fija con formaldehído. 2. Lisas la célula, la rompes, y tienes tu lisado en el eppendorf. 3. Luego sónicas, que es fragmentar el dna, con ultrasonidos, los fragmentos pueden ser de 1000bp. 4. Ahora usas el anticuerpo que reconoce la proteína (o lo que queremos, el anticuerpo debe unirse a esa modificación) y luego la resina, centrifugas y tendrás la proteína unida al dna en el fondo del eppendorf. Después de los lavados eluyes la cromatina y las proteínas se quedarán arriba, con esta cromatina haces una qPCR (en tiempo real, cuantitativa, vas midiendo la cantidad de dna que se va amplificando). Lo amplificas y vas a ver el enriquecimiento del fragmento. Si sabes en que gen estas mirando la polimerasa, puedes diseñar tus primers y ver donde esta tu polimerasa. El tema es que quieres ver en que parte del gen esta la polimerasa. Puedes usarlo también para ver modificaciones de las histonas, no solo para buscar la polimerasa. La proteína que buscas es la histona, usas anticuerpos para esa histona. Has puesto primers para todas las zonas del dna y luego si haces una gráfica no aparecerá nada en los primers que se unen a las histonas que no quieres, pero en las

7

histonas donde está la proteína que buscas, esos primers amplificaran el dna y te saldrá en la gráfica. Otra cosa a parte de la qPCR es hacer una secuenciación del dna que he precipitado y luego lo busco con un programa informático a ver a que secuencia del dna pertenece. *Ejemplo:

Si no sabes el gen con el que trabajas, no usas una CHIP qPCR, si no una CHIP sec. Lo que haces es: 1. Tienes una célula y en su núcleo tienes toda la cromatina, puede haber polimerasa en cualquier lado. 2. Haces lo mismo que antes, pero al final, el DNA que eluyes lo secuencias por NGS, secuenciación masiva, y encontrare todos los fragmentos donde la polimerasa este unida. Arriba del eppendorf se quedan los fragmentos que no tengas unida la polimerasa. Estas viendo en todo el genoma donde tengo unida la polimerasa. 3. Secuencias los fragmentos donde tienes polimerasa. En la vida real no tienes una sola célula, sino millones que sacas de tu placa Petri, por lo que tendrás resultados de todas las polimerasas de todas las células. Cuando secuencias el fragmento más enriquecido es el que no se ha ido con los lavados, el que tiene la polimerasa. Esto es una chip sec: el pico más alto es donde está la polimerasa. Te dice dónde están todas las polimerasas, hasta la que esta pausada. Si usas un anticuerpo contra la polimerasa serina 2, veras la polimerasa pausada. Si lo usas contra la polimerasa serina 5, veras la que este activa.

Si queremos saber si un ft que esta unido al promotor ejerce alguna función sobre este usamos un GFP u otro (proteína chivato) para ver si ese ft regula al promotor. Hay que ver si el gen que esta detrás del promotor, si se activa, inhibe… si ese factor activa la transcripción tendrás más proteínas, por lo que si cuantificas el producto lo puedes detectar. ¿Como mides el mRNA? con un northern blot, igual que el western (para proteínas y southern para dna) pero con rna, haces

8

un gel desnaturalizante, lo pasas a una membrana e hibridas en esa zona con sondas complementarias al rnam que buscas, por lo que lo vas a encontrar. El northern es para RNA pero la sonda es de DNA. Para detectar esto también puedes hacer una RTqPCR, pasamos el rnam a dna, con un retrotranscripcion y luego lo amplificas. Inmunoprecipitacion de proteínas o coinmunoprecipitacion ej: tenemos la proteína A en una célula, y esta prot A se une a la prot B pero no a la prot C, la A y la B están formando un dímero, eso es lo que tenemos en la célula. Queremos ver a quien se une la A, hacemos una inmunoprecipitacion con un anticuerpo contra A e inmunoprecipitamos, al hacer esto se nos queda lo que tiene anticuerpo, la C y el resto de las proteínas no se nos quedan, solo la A y la B, podemos luego cargar en un gel y hacer un western, las membranas del western se pueden rehibridar. Te da una banda donde sabes que esta la proteína A. Has hecho un western con un anticuerpo anti A, o un anticuerpo anti B, en esa misma membrana lo haces con un anti C. Si lo que ha precipitado lo corro en un gel y lo hacemos con un anti A o anti B nos sale una banda en el mismo sitio pero si lo hago con un anticuerpo anti C no vemos nada. Cuando haces el fijado o crosslink haces que cosas que están cerca crosslinkeen, que hagan enlaces covalentes entre ellas. Con una inmunoprecipitacion de proteínas ves si hay proteínas que están próximas, por eso haces crosslink por que hace enlaces covalentes entre ellas, unes esas cosas por que, si no lo haces, si estas proteínas no tienen unión covalente, una precipitaría y la otra no, por que si quieres estudiar su proximidad, eso quiere decir que las proteínas no están unidas covalentemente, por eso las unes tu con la fijación.

9...