Tema 5 PDF

Preview

Summary

Download Tema 5 PDF

Description

Enginyeria genètica de microorganismes

TEMA 5: FUSIONS GÈNIQUES EN BACTERIS 5.1 Introducció La definició clàssica és la unió de dos gens, normalment un gen objecte d’estudi + un gen indicador. Ara bé, últimament es fusionen també tags i la definició de “dos gens” ja no és gaire correcta. Les fusions tenen moltes utilitats:       

Donar un promotor diferent a un gen. Posar-li un reporter --> localització de proteïnes. Interaccions: sistemes de doble híbrid --> veure si les proteïnes interaccionen. Estudi i identificació de promotors. Estudi de l’expressió gènica. Purificació de proteïnes. Vacunes, Carriers...

Trobem dos tipus bàsics de fusions gèniques, les transcripcionals i les traduccionals: 

Fusions transcripcionals: En aquest cas fusionem dos mRNA en un mateix promotor, per entendre’ns. Per tant el segon gen haurà d’incloure la seqüència RBS per tal de poder iniciar la traducció de nou i els productes gènics (proteïnes) no quedaran fusionats. També entra dins d’aquest grup quan un gen s’introdueix a l’interior d’un altre i aquest queda truncat. En termes de bona escriptura quan parlem d’una fusió gènica ho hem d’escriure: genX :: gen indicador. El “::” indica fusió gènica. Quan l’indicador interromp el gen d’interès, ho especificarem així: genX’ :: gen indicador. El gen X serà el que està al N-term. Un apòstrof (genX'::'genY) indica que falta un tros al 5' del gen, si l'apòstrof està a l'esquerra, o al 3' si l'apòstrof està a la dreta.

Com sempre hem de tenir en compte que estem parlant de bacteris i aquests tenen unitats policistròniques. Si seguint el segon exemple introduïm un gen indicador en una unitat policistrònica poden passar un seguit de coses: 1) Si no hi ha terminador transcripcional en el gen indicador només truncarà el gen on caigui. 1

Enginyeria genètica de microorganismes 2) Si el gen indicador té terminador transcripcional no es produirà res a partir de la inserció. Tindrem un efecte polar que s’ha de tenir en compte.



Fusions traduccionals: El gen indicador es tradueix conjuntament amb el gen d’estudi, tot generant un producte híbrid. Quan es fa la fusió s’ha de tenir en compte el marc de lectura dels dos gens, a part que no hem d’incloure la seqüència RBS. Pel que fa a les unitats policistròniques trobem el mateix raonament.

Ara anem a veure alguns d’aquests gens indicadors. El primer que ens ve al cap és la GFP. Però en trobem d’altres: 

Marcadors metabòlics: o xylE: Degrada el catecol. o gus (b-glucoronidasa). L'equivalent a lacZ en molts bacteris. o lacZ (beta-galactosidasa).



Marcadors fluorescents o bioluminiscents: o gfp i derivats d'altres colors. o luxAB: S’utilitza poc donat que s’ha d’afegir substrat per enzims que els trenquen i produeixen llum. S’usen sobretot quan no pots irradiar per aconseguir fluorescència.



Gens de resistència a antibiòtics: S’utilitzen per fer seleccions positives, com per exemple quan els posem sota control de promotors dels quals volem esbrinar quan s’activen. Aquells que s’activin faran resistents a la soca i la podrem seleccionar de forma directa.



Gens de resistència a metalls pesants.



Gens per anclatge de proteïnes.

2

Enginyeria genètica de microorganismes

5.2 Mètodes per construir fusions gèniques 5.2.1 Fusions a l'atzar En les quals no tenim ni idea d’on caurà el gen reporter, però esperarem una fusió correcte en alguna o altra ocasió. El més fàcil en aquest cas és fer fusions transcripcionals donat que només cal que caigui sota el control d’un promotor. Podem fer servir: 1) Transposons. Vaja, mini-transposons com els vistos en el tema anterior. Aquests portaran el gen reporter i la seqüència de tall. (Recordar que si és fusió transcripcional ha d’incloure el senyal per RBS). Trobem diferents gens indicadors, com resistències Km, Tc o el mateix lacZ. Un dels marcadors que s’utilitza més en aquests casos és el phoA (fosfatasa alcalina). En aquest cas, però, és una fusió traduccional. Cada transposó com s’observa a la imatge de sota porta el seu propi gen marcador i el gen de resistència propi (envoltat del cercle vermell). Aquest caurà a l’atzar en algun gen i si el salt entra en frame es generarà una proteïna de fusió.

La gràcia d’usar el phoA és que la Fosfatasa Alcalina NOMÉS és activa fora de la cèl·lula i, per tant, podrem determinar si s’ha ancorat en una proteïna citosòlica (no veurem activitat) o ancorada a la paret (sí que veurem activitat). Evidentment a la seqüència del gen phoA que introduïm al transposó li hem d’eliminar el seu propi pèptid senyal que l’envia a la paret. Per altra banda és evident, també, que aquest gen només es pot fer servir en aquells que no continguin de forma intrínseca el phoA.

3

Enginyeria genètica de microorganismes La idea és que al tenir un gen marcador en el transposó SENSE PROMOTOR quan salti a l’atzar al genoma quedarà sota el control d’un promotor d’un gen intrínsec. Cada salt de la teva genoteca, doncs, vindrà controlat d’una forma diferencial i fent servir tal o qual condició podràs observar variacions en l’expressió que et permetran identificar quan s’activen els promotors. En aquest camp, però, els arrays transcripcionals i la piroseqüenciació quantitativa són molt més senzills i fan que aquesta estratègia no s’utilitzi gaire, només quan realment no tenim ni idea de amb què estem treballant. 2) Vectors fàgics transponibles.

5.2.2 Fusions no a l'atzar En aquest cas tenim clar el nostre objectiu. Ho podem fer de dues maneres:  

Fusions contingudes en plasmidis. Fusions dirigides sobre el cromosoma bacterià: Fetes normalment per recombinació homòloga. Ens serveixen per marcar una cèl·lula o determinar l’expressió d’un gen conegut mitjançant un indicador. El procediment és senzill: flanquejar amb dues regions homòlogues al genoma el gen reporter que vulguis introduir al genoma i posteriorment transformar el vector generat. Un exemple. Posem GFP sota el control del promotor recA (sistema de reparacions SOS). Així doncs quan s’expressi GFP voldrà dir que hi ha lesions donat que el promotor s’estarà expressant. Hauríem de fer servir un plasmidi suïcida o condicional (RK6, per exemple). Després es transforma i es busca sempre la doble recombinació, introduint –normalment – una resistència al downstream de GFP que et permeti seleccionar.

5.3 Aplicacions amb exemples de fusions 5.3.1 Sistemes d'expressió in vivo : Sistema pIVET (In Vivo Expression and Transcription) Es tracta de sistemes que permeten determinar l'expressió de gens deixant "memòria" a través de la sensibilitat a un marcador de resistència antibiòtica. Utilitzem una fusió transcripcional posant sota control del promotor que volem estudiar una transposasa. La idea bàsica del pIVET és que els fragments clonats al MCS (possibles vectors) quedaran controlant una transposasa. Això ens permetrà saber si el promotor s’expressa en algun punt en les condicions que ens interessin (la transposasa s’expressarà).

4

Enginyeria genètica de microorganismes

5.3.2 Sobreexpressió i purificació de proteïnes mitjançant pET La idea d’aquests vectors és fer servir fusions traduccionals com a sistemes de sobreexpressió i purificació de proteïnes. S'hi afegeixen per exemple cues d'histidines o altres proteïnes senceres que serveixen per poder "pescar" la proteïna quan purifiquem. Un dels més usats és el sistema dels vectors pET.

Bàsicament presenten un promotor de T7 amb un operador lac (induïble per lactosa) que el fa ser induïble a IPTG. Les cèl·lules que contenen el plasmidi pLys aconsegueixen tenir una expressió molt baixa gràcies a què aquest altre plasmidi conté lisozim, que reconeix un epítop de la polimerasa de T7 i la inactiva. L'expressió del lisozim és constitutiva, és a dir, sempre hi ha enzim. A l'induir el sistema es produeix molta més polimerasa per tant la sobreexpressió s'aconsegueix igual. Posteriorment un MCS i una cua d’histidines que permet la purificació via unió a cations divalents o anticossos. La idea final és una matriu amb columnes d’afinitat, normalment amb Niquel o Sepharose on quedarà atrapada la cua d’histidines. Tot i així últimament aquest tipus de columnes ja no s’utilitzen tant i s’està tirant més cap a l’ús de partícules magnètiques. S’uneixen els anticossos en qüestió als magnetic beads i aquests van directament al cultiu i es recuperen posteriorment amb un iman.

5

Enginyeria genètica de microorganismes

5.4 Altres utilitats de les fusions gèniques Com a eina genètica ens permeten molta originalitat. Només cal pensar que ho podem fer per fer-ho. Tot està per fer i tot és possible. Avui dia està molt de moda el que s’anomena pulldown o mètode d’arrossegament. És una manera gràfica de definir la co-purificació per esbrinar quines proteïnes interaccionen entre sí. A la proteïna de la qual vols esbrinar la interacció li fas una fusió gènica amb un epítop que ja disposi d’anticòs comercial. Posteriorment uneixes aquest anticòs a una de les esmentades magnetic beads i l’arrossegues i observes amb qui ha interaccionat.

5.5 Construcció de fusions in vitro 

Usant un vector i el seu MCS: Volem fusionar el genX amb el genY (genX::genY). Es fa PCR amb un oligo en què al cantó 3' del gen X hi ha seqüència complementària (amb diana de restricció igual) al cantó 5' del gen Y. També es pot agafar el genX, es clona en un MCS i després es talla el vector per la zona de restricció i s'hi afegeix el genY. Una altra opció és la PCR inversa, en cas que el MCS no ens vagi bé.



Per PCR overlap extension: Si volem fusionar genX i genY, fem una PCR en què hi ha un oligo complementari al gen X i un dels oligos amb una cua complementària del genY. El mateix per al genY (amb un dels oligos amb una cua complementària al genX). Fins aquí tenim dos productes independents no fusionats. A partir d'aquí es fa una PCR amb DNA motlle els productes de les dues primeres PCR, per tant no posarem nous oligos de moment. Com tenim regions complementàries, les dues cadenes diferents s'ajuntaran en la renaturalització del cicle de PCR i els extrems serviran com a oligos per crear el producte de fusió (competiran en la renaturalització amb la cadena totalment complementària). Llavors si volem amplificar aquest producte de fusió hi ficarem oligos i ja tindrem el producte per amplificar. Limitació: Oligos de 100bp, per tant el solapament pot ser de màxim de 100 bp.

6

Enginyeria genètica de microorganismes 

Gibson assembly: Partim dels fragments de dsDNA amb overlapping ends. La idea de solapament és la mateixa que en l'overlap extension, però es faran servir uns enzims que actuaran de manera coordinada. Primer actuarà una exonucleasa que degrada l'extrem 5', deixant unes regions complementàries entre elles ja que no tenim doble cadena en l'extrem. Per complementarietat s'uniran els extrems lliures però l'acció de l'exonucleasa no la podem controlar i pot haver tallat més del compte, deixant gaps. Això no és un problema perquè quan la polimerasa extengui els extrems 3', després afegim una lligasa que uneixi els "nicks" o forats que quedin creant l'enllaç fosfodiéster.



Amb tècniques LIC (ligase independing cloning): Vol dir "independent de ligació". Amb PCR es generen extrems lliures. El kit fa servir una polimerasa del fag T4 que té activitat exonucleasa. Es generen extrems complementaris i es fa una recombinació. Això es transforma a una cèl·lula i aquesta ho repara amb les seves pròpies polimerases.

7

Enginyeria genètica de microorganismes



In-Fusion PCR Cloning Kit:

COMPROBAR LA SEQÜÈNCIA PER CONFIRMAR QUE TOT ESTÀ CORRECTE

8...