Tema 5 - Proteínas PDF

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TEMA 5: LAS PROTEÍNAS GLOBURALES. MIOGLOBINA Y HEMOGLOBINA. La terminación de mioglobina y la hemoglobina indica que son proteínas globulares. La mioglobina fue la primera proteína cuya estructura tridimensional se conoció a nivel atómico. La hemoglobina fue la primera proteína en cristalizarse. Estas proteínas fueron las primeras con las que se pudieron establecer relaciones con patologías. Tienen la función biológica de unir un ligando, de forma que fueron el banco de pruebas donde se realizaron las primeras teorías de unión de ligandos. INTRODUCCIÓN A LAS PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE OXÍGENO Ninguna cadena polipeptídica tiene la capacidad de unir reversiblemente el oxígeno, la mioglobina y la hemoglobina tienen esta capacidad gracias a la presencia de un grupo hemo. La vida en la Tierra ha ido evolucionando desde la anaerobiosis a la aerobiosis, se obtiene más energía en presencia de oxígeno que en ausencia de éste. El O2 puede disolverse, y por mera difusión llegar a las células (aunque la velocidad de difusión es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia). Por tanto, evolutivamente se fueron sintetizando sistemas de circulación (o de tráqueas que aproximan el aire atmosférico más al interior) para llevar el O2 a los lugares que no están en contacto directo con la atmosfera, a los tejidos y órganos internos. Pero el sistema circulatorio no es todo, ya que el O2 es soluble (aunque no mucho, 0,1 mM concentración de O2 disuelto en agua) en agua. Para aumentar la concentración de O2 disuelto son necesarias moléculas que unan y liberen este O2 a la par que lo transportan, una de estas moléculas es la hemoglobina. Como su misión no solo es aumentar la concentración de O2 disuelto, sino también transportarlo, no solo es importante la capacidad de unir O2, sino también de liberarlo. ESTRUCTURA DEL GRUPO HEMO No hay ningún grupo de aminoácidos que sea capaz de unir O2, pero sí existen ciertos metales de transición, como el hierro y el cobre, que tienen esta capacidad. Las proteínas transportadoras de oxígeno se han dotado de un grupo prostético que contiene Fe 2+ (el Fe2+ no puede andar suelto porque sería perjudicial dando lugar a radicales libres que dañan el DNA y macromoléculas). El hierro está incorporado a un grupo protético unido a una proteína, llamado grupo hemo. El grupo hemo contiene en su estructura un anillo de protoporfirina IX unido a un único Fe2+. El anillo de protoporfirina está formado por cuatro anillos heterocíclicos, llamados pirroles y unidos por enlaces meteno, es por tanto, un tetrapirrol. La mayoría de los grupos funcionales que rodean la estructura de protoporfirina son hidrofóbicos (metilo, vinilo...) aunque hay algunos, como propionatos, hidrófilos. El grupo hemo tiene una determinada orientación dentro de la proteína, la parte hidrofóbica hacia el interior y los propionatos hacia el exterior. El átomo de hierro del grupo hemo posee seis enlaces de coordinación: cuatro de ellos unidos al anillo de plano de la porfirina y en su mismo plano, y otros dos perpendiculares a este plano, que quedan libres. En esta estructura el hierro es mucho menos reactivo (y no perjudicial) que cuando está en disolución. Además si el grupo hemo estuviese libre, éste podría unir O2 igualmente, pero malamente. Así mismo el Fe2+ podría pasar a Fe 3+, de forma que ya no uniría O2, ya que es necesario que el grupo hemo tenga el

hierro reducido para ser capaz de unir O2. Si solo se encontrase el grupo hemo, sin la proteína, se presentaría el siguiente problema: dada la electronegatividad del oxígeno, dos grupos hemo tenderían a unirse. No se pasaría del primer ciclo de unión de oxígeno, ya que se oxidan los grupos hemo. Se llevó a cabo un experimento en el cual se fabricó un hemo sintético, un hemo vallado, se le añadieron unas cadenas de forma que fuese imposible que se acercase a otro hemo y se uniese, de forma que unía el oxígeno reversiblemente, sin oxidarse el grupo hemo. En la naturaleza es la proteína la que da el entorno adecuado para el grupo hemo. El hemo se localiza en una oquedad, donde la mayoría de residuos son residuos apolares, pero hay también dos histidinas muy importantes: -

Histidina F8 o proximal, que enlaza con su nitrógeno del grupo inmidazol con el hierro del grupo hemo, en su quinta posición de coordinación. De forma que solo queda uno de los sitios de unión disponible para el oxígeno.

-

Histidina E7 o distal, que entorpece la entrada de otros ligandos, ya que el hierro puede unirse a más cosas que el O2, como por ejemplo el CO, el NO y el H2S. Por tanto, la proteína ayuda a la selectividad. Además esta histidina ayuda a estabilizar el oxígeno cuando está unido (formando un puente de hidrógeno).

Esta estructura no es una estructura estática, la unión del oxígeno produce cambios de conformación que se van a transmitir a la proteína. Así mismo, esta estructura puede tener oxígeno unido o no, dando lugar a cambios de color con distintos espectros de absorción: En el tercer caso, en el que el hierro está oxidado, para que este hierro pueda volver a unir oxígeno es necesario reducirlo. Existen unos enzimas, las metaHb o metaMb reductasas, que son los encargados de reducir el hierro que se había quedado oxidado.

El ligando natural de estas proteínas es el oxígeno, pero en condiciones fisiológicas existen otros ligandos que pueden unirse. El CO (monóxido de carbono), es uno de los ligandos, es un gas tóxico, en el cual existe un triple enlace entre el C y el O, de forma que el CO se une de forma perpendicular al plano de unión. El CO se une 25.000 veces mejor que el oxígeno al grupo hemo, por esta razón es tan tóxico, se produce una muerte por asfixia metabólica. El enlace con la histidina proximal hace que el grupo

hemo no sea una estructura planar, sino que el hierro está sacado hacia el lado contrario de la unión del oxígeno. El oxígeno al unirse se une de forma angular:

La imagen del medio representaría a situación si no estuviese presente la histidina distañ. Sin embargo la histidina distal consigue que el CO no se una perpendicular al plano hemo, sino que se una de formar angular, disminuyendo así la afinidad de unión. Así que por tanto, la histidina distal por un lado estabiliza el oxígeno y por otra parte actúa como impedimento estérico dificultando la unión del CO. MIOGLOBINA Es una proteína monomérica, relativamente pequeña, tiene 153 residuos (similar al tamaño de cada una de las subunidades de la hemoglobina). Pese a que la forma es parecida a la hemoglobina, las secuencias son distintas. Se encuentran zonas de estructura secundaria en forma de hélice α, aproximadamente el 75% de su secuencia. Hay 8 tramos de hélice α que se nombran con letras, a partir del extremo amino: hélice A, hélice B, hélice C… y a las regiones entre hélices que no tienen disposición helicoidal se las llama con las letras de las hélices entre las que se encuentra, por ejemplo, región AB. Para nombrar un residuo se puede hacer de dos formas diferentes, por ejemplo: Histidina 93 o histidina F8 (octavo residuo dentro de la hélice F), en este caso recibe otro nombre también, la histidina proximal. Otro ejemplo es la histidina 65 o histidina E7, que es la histidina distal. Es una proteína compacta. Todo el interior es un ambiente hidrofóbico, salvo las histidinas distal y proximal. El grupo hemo se encuentra en una oquedad cerca de la superficie. Cuando no lleve el oxígeno unido, el hierro no está en el plano del grupo hemo, sino que se encuentra acercado a la histidina proximal. HEMOGLOBINA Es una proteína tetramérica, está formada por cuatro cadenas: 2α (de 143 residuos cada una) y 2β (146 residuos cada una). Esto es la estructura de la hemoglobina en el adulto. Sin embargo desde el desarrollo embrionario hasta el nacimiento, las subunidades de la hemoglobina son distintas, es decir, existen análogos funcionales de las cadenas α y β, como por ejemplo: ξ de la α, y ε, γ y δ de la β. Las cuatro cadenas están dispuestas en posición tetraédrica. Las cadenas α tienen poco contacto entre sí, lo mismo ocurre con las cadenas β. Sin embargo entre las cadenas α y β hay amplias zonas de contacto, de forma que podríamos contemplar el tetrámero como un dímero de dímeros, es decir, que la hemoglobina está compuesta por dos subunidades cada una de ellas compuestas por una cadena α y y por una β. También es lógico considerarlo así porque la unión de O2 produce cambios en uno de los dos dímeros de dímeros.

Las cadenas α y β son funcionalmente similares a la de la mioglobina, cada una de ellas tiene un grupo hemo en una oquedad. Sin embargo su secuencia lineal es muy distinta, solo tienen un 18% de similitud (unos 27 aminoácidos). No obstante hay residuos conservados en ambas: histidina distal, histidina proximal, algunas glicocolas… Las cadenas α son iguales entre sí, y la cadenas β son iguales entre sí. UNIÓN DE LIGANDOS Consideremos un proceso en el que el ligando (L) se une reversiblemente a un sitio único de la proteína (P). P + L PL, con ka hacia la derecha y kd hacia la izquierda. Se tiene entonces que: ka[P][L]=kd[PL]. Se observa que ka representa un proceso de segundo orden con dimensiones M -1s-1, y que kd representa un proceso de primer orden con dimensiones s-1. Después de algún tiempo el proceso alcanza el equilibrio, cuando las velocidades de asociación y disociación son iguales:

Donde Ka es la constante de asociación y tiene unidades M -1. A mayor Ka, mayor afinidad de P por L. La constante de disociación sería la inversa y tendría unidades M. A mayor Kd, menos afinidad de la proteína por el ligando. -

Unión fuerte: Kd10nM, proceso de baja afinidad.

La unión de un ligando a un proteína se puede considerar como un equilibrio químico. En el caso de las proteínas que pueden saturar la unión, es importarte considerar la fracción de saturación. La fracción de saturación hace referencia a la fracción de unión de sitios ocupados, también se llama theta, θ o Y. Sustituyendo [PL] por Ka[P][L], diviendo entre Ka[P] y reordenando resulta la siguiente ecuación:

Se obtiene una relación hiperbólica. Si θ=0,5 entonces Kd=[L]. Entonces Kd es la concentración de ligando que produce la semisaturación y tiene unidades de saturación.

UNIÓN DEL O2 A LA MIOGLOBINA Y A LA HEMOGLOBINA

(1)

Sustituyendo [MbO2] de (1) tenemos:

Cuando el ligando es un gas, como en este caso, normalmente no se expresa en concentraciones, sino en presiones parciales (1Torr=1mmHg)

La hemoglobina no tiene comportamiento hiperbólico, mientras que la mioglobina sí.

Si =0,5, entonces podemos calcular K d y Kd=p50. Por tanto el p50 es aquella presión parcial de O2 que da lugar a la semisaturación. Mbp50=2,8 Torr. Cuanto más pequeño sea p50, más alta será la afinidad. Rango aproximado de la disponibilidad de O2  100 Torr pO2 en los pulmones, mientras que en el músculo es menos que en los pulmones, en reposo 40 y consumiendo O2 activamente, 20. Cuando la Mb está a una presión parcial elevada, tiene casi el 100% de sus sitios ocupados. A una presión parcial menor (un 10%) solo suelta un poco de gas que llevaba unido. Si comparamos con la Hb, puede liberar más gas del que lleva unido (80%). Por tanto, la Mb está diseñada para almacenar oxígeno, mientras que la Hb para el transporte de O2, ya que tiene gran capacidad de descarga. La mioblobina se encuentra en gran cantidad en las ballenas, en cachalotes… permitiendo el gran tiempo de inmersión. La Mb no es vital, por ejemplo, un ratón al que se le quite los genes que codifican para la Mb (un knock-out), el ratón vive, lo único que ocurre es que sus músculos son más blancos en vez de más rositas y el daño oxidativo es más grande. La Mb se encuentra principalmente en el músculo, pero tiene análogos funcionales en otros tejidos, como la neuroglobina en el cerebro. COOPERATIVIDAD ABSOLUTA La forma de la curva de la Hb no puede explicarse por la ecuación de la hipérbola. Intuimos que esto se debe a la presencia de los cuatro sitios de unión, pero si la afinidad y la influencia de unos sitos de unión sobre otros no existiese, la curva sería una hipérbola. Archibald Hill dedujo que puede haber influencia de unión de unos ligandos sobre la unión de los siguientes.

Imaginemos una proteína capaz de unir n residuos de ligando (une n residuos cuando la fracción de saturación es 1). Por tanto, n es el número posible de sitios de unión, al menos esa es la prospuesta inicial. A este fenómeno de la unión completa o liberación total se le llama cooperatividad absoluta.

No es la ecuación de una hipérbola para cualquier valor de n. Tan solo es una hipérbola cuando n es igual a 1.

¿Cómo de dependientes son las uniones de los ligandos? n=1 hipérbola  unión independiente n>1 cooperatividad positiva (la unión de los sitios siguientes está facilitada por la de las precedentes) n1 (aproximadamente 3), en esa zona intermedia, hay cooperatividad positiva. Se puede conseguir mutantes en la hemoglobina, de forma que tengan la cooperatividad más alta o más baja. Esto causa problemas, si la cooperatividad es demasiado alta no suelta el ligando y si la cooperatividad es demasiado baja se va a comportar como si fuera no cooperativa. FUNCIONALIDAD MODULABLE DE LA HEMOGLOBINA El O2 actúa tanto como ligando como modulador. Por debajo del 10% de saturación la pendiente tiende a 1, es decir, la hemoglobina se comporta como una proteína no cooperativa, con un p50 elevado (de unos 30), es decir, baja afinidad. Esta situación se da cuando la hemoglobina está captando la primera molécula de O2. Cuando la presión parcial es muy alta, por encima del 90%, la curva también tiene pendiente 1, de forma que la hemoglobina no es cooperativa, con un p50 muy bajo (de unos 0,3), es decir, mucha afinidad. Esta situación se da cuando la hemoglobina está cercana a la saturación (cuando ya tiene tres moléculas de O2 unidas). Estos cambios de comportamiento están basados en cambios estructurales modulados por el O2 (efector alostérico), se trata de una regulación homotrópica.

Existen otros moduladores, efectores, que no son el oxígeno, el propio ligando, y en este caso es una modulación heterotrópica. Experimento: separar las cadenas de la hemoglobina pero preservando la estructura terciaria de cada cadena. Por ejemplo se consigue con urea, se obtienen así las cadenas β y las cadenas α por separado. Las cadenas α tienden a quedarse aisladas, pero las cadenas β tienden a asociarse unas con otras formando tetrámeros. Estudiando la cinética de las cadenas aisladas se obtiene que éstas tienen un comportamiento hiperbólico. Por tanto, para que tenga lugar el verdadero comportamiento de la hemoglobina, el no hiperbólico, es necesario que estén los dos tipos de cadenas. INTERACCIONES α-β EN LA HEMOGLOBINA La hemoglobina se puede separar en dos parejas de cadenas α-β. Es decir, hay una interacción muy fuerte entre α y β, e interacciones más débiles entre α-α y β-β. Por tanto, la hemoglobina puede considerarse como un tetrámero formado por dos dímeros. Durante la oxigenación se producen pocos cambios en los contactos α1β1 o α2β2. FORMAS DE LA HEMOGLOBINA

Hay una transición entre dos estados conformacionales de la hemoglobina (modulación alostérica): el estado T (tenso, forma desoxigenada), y estado R (relajado).

En el estado T hay una oquedad en el centro del tetrámero, la unión de O2 da lugar a la disminución de la oquedad. De forma que la oxigenación da lugar a un cambio de estructura entre dos posiciones alternativas, la T y R. Las diferentes estructuras son posibles gracias a las interacciones α1-β2 y α2-β1. Los residuos interaccionan de manera diferente en función de la conformación T y R. Las conformaciones T y R se mantienen estables gracias a las interacciones. Los puntos de contacto entre α1-β1 y α2-β2 apenas cambian, pero sí cambian las interacciones α1-β2 y α2-β1. La estructura T se llama así porque está estabilizada por unos enlaces que la hacen más rígida. La estructura R se llama así porque se rompen estos enlaces y es menos rígida. MECANISMO DE PERUTZ Perutz fue el señor que propuso el mecanismo para explicar los cambios conformacionales y de afinidad de la hemoglobina por el ligando. -

Cuando el oxígeno se une al Fe2+, éste se desplaza hacia el interior del anillo 0,06nm arrastrando la hélice F. Este hecho no tiene transcendencia en la mioglobina, pero en la hemoglobina inicia un cambio conformacional. Un par de subunidades αβ gira 15º respecto al otro. Cuando un cristal de desoxiHb se expone al oxígeno, se rompe indicando un cambio de estructura.

Por tanto, la oxigenación produce una reorientación de la histidina, que se acerca al grupo hemo. Como la histidina proximal está unida a la hélice α el cambio de conformación se traduce a esta. Esta primera unión no es suficientemente fuerte como para provocar el cambio estructural de la proteína completa, pero cuando se une el segundo oxígeno, ya se producen más cambios estructurales (el giro de 15º), de forma que se va a unir el O2 más fácilmente. PUENTES SALINOS EN LA DESOXI-HEMOGLOBINA Los extremos carboxilo de la hemoglobina oxigenada, de cualquiera de las dos cadenas, pero sobre todo de las dos cadenas β, no se ven, son como una mancha, porque son residuos móviles. Sin embargo, en la desoxiHb estos extremos están flojos, esto se debe a que en la desoxiHb están formados varios puentes salinos. Los iones cloruro ayudan a estas asociaciones. Hay ocho puentes salinos muy importantes, en los que participan los grupos carboxilo terminales (no solo interaccionan por su carboxilo terminal del residuo carboxilo termina, sino que también pueden interaccionar por sus cadenas laterales). Ejemplo: hay una histidina que cambia el pKa de su grupo

inmidazol debido al entorno, acidez de la sangre, de manera que está protonado ya que aumenta su pKa y a pH=7 (fisiológico) está protonado y puede formar el puente salino. Los residuos que participan en puentes salinos, pese a que en la secuencia lineal están lejanos, el plegamiento hace que queden próximos. Cuando la proteína se oxigena, estos ocho puentes salinos desaparecen. MODELOS PARA EXPLICAR LA COOPERATIVIDAD

Modelo concertado o simétrico (Monod-Wyman-Changeux). La molécula solo puede existir en dos estructuras alternativas en las cuales todos los protómeros en una misma estructura están o todo T o todos R. Ambas formas, T y R, pueden unir el ligando, pero la forma R lo une con más facilidad. En ausencia de ligando, el equilibrio está desplazado hacia T. A medida que se van uniendo oxígenos, los equilibrios se desplazan hacia la forma R. El problema de este modelo es que no puede explicar la existencia de un caso de cooperatividad negativa. Modelo secuencial (Koshland). Este modelo tiene más verosimilitud. La unión de un ligando a uno de los sitios de unión produce un cambio de conformación en la subunidad a la que se ha unido, pasa de T a R. Así mismo, también relaja un poco la conformación de las subunidades adyacentes.

La hemoglobina es una transición entre ambos, al principio se comporta como una proteína de baja afinidad y luego de alta afinidad.

EFECTO BOHR Efecto Bohr: los H+ y el CO2 disminuyen la afinidad de la hemoglobina por el O2. Como ya hemos dicho, la hemoglobina transporta otros ligandos que no son O2. Estos otros ligandos son moduladores alostéricos en el transporte de O2. Estos ligandos que une la hemoglobina son los protones y el CO2, los cuales disminuyen la afinidad de la hemoglobina por el O2. -

El CO2 es un producto del metabolismo celular que debe ser transportado a los pulmones para su liberación. La mayor parte del CO2 es convertido en bicarbonato. Si no fuese por la presencia de la anhidrasa carbónica, sería un proceso demasiado lento. Como consecuencia de esta reacción se produce una acidificación del medio. Además el equilibrio también es importante de cara al transporte de CO2.

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Una parte del CO2 puede unirse a los extremos amino de la hemoglobina, formando carbamatos. También se produce una acidificación del medio.

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Las dos reacciones anteriores, ...