Tema 5. Técnicas electroforéticas PDF

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Grado de Genética – T. T Gloria Hidalgo TÉCNICAS ELECTROFÓRETICAS 1. PRINCIPIOS BÁSICOS La electroforesis es el proceso de separación de moléculas cuando se aplica un campo eléctrico, el cual provoca el movimiento de las moléculas hacía un electrodo u otro. Normalmente se utiliza con fines analítico...

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Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo

TÉCNICAS ELECTROFÓRETICAS 1. PRINCIPIOS BÁSICOS La electroforesis es el proceso de separación de moléculas cuando se aplica un campo eléctrico, el cual provoca el movimiento de las moléculas hacía un electrodo u otro. Normalmente se utiliza con fines analíticos, es decir, que no es una técnica de purificación. Las aplicaciones están asociadas al cálculo de pesos molecular (proteína y DNA), la caracterización molecular o para comprobar la pureza (método por excelencia). A veces se puede usar para purificación a pequeña escala; de hecho, muchas veces, para hacer clonajes se escoge la banda del gel del vector diferido y se extrae esta banda para clonarla mediante procesos de degradación de la agarosa o mediante electroelución (esta misma banda la vuelves a poner en un tampón y le vuelves a poner un campo eléctrico): se sacan las moléculas del soporte donde estaban.

De manera general se aplica un campo eléctrico, que está entre dos electrodo, y la molécula si tiene carga se moverá en un sentido u otro. Así pues la fuerza electroestática provocará el movimiento de las moléculas con carga (Ej: el DNA tiene carga negativa y migrará hacia el positivo). También tiene un papel importante el efecto de la difusión, que está en los dos sentidos. La intensidad del campo eléctrico que se aplica tiene que ser suficiente para que la fuerza de componente electroestático sea más fuerte que el efecto de la difusión. Es por eso que en todas la electroforesis hay un mínimo voltaje y un máximo voltaje – se limita para que no mande la difusión.  Normalmente los geles de DNA se corren entre 1-5V por centímetro entre los electrodo, es decir, que para cada cubeta y tipo de gel puede a variar el voltaje (depende de la distancia entre los electrodo). Si nos respetamos estos límites dejamos de tener bandas definidas para tener machas relacionadas con las difusiones. Generalmente el máximo del voltaje vienen dado porque se derrite el gel (tanto agarosa como acrilamida: viene por la naturaleza del soporte) y el mínimo se determina para poder extraer bandas definidas. 1.1. PARÁMETROS Movilidad electroforética (U): velocidad molécula (V=cm/s) por intensidad de campo eléctrico (E=volts/cm). Es decir, cuanto avanza una molécula en un tiempo determinando aplicando un campo eléctrico de determinado valor. Los factores que influyen en esta migración electroforética son:  Campo eléctrico: depende la diferencia de potencia (v/d), de la intensidad (i), la resistencia (Ω) que ejerce el material y de la temperatura a la que se está haciendo la electroforesis.  Moléculas: se moverá en dependencia de su densidad de carga (relación carga/masa) → según el tamaño, la forma (volumen) y la carga característica de la molécula. 1

Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo  Tampón. o Fuerza iónica: cantidad de iones que contiene que generaran la intensidad de corriente. o pH (normalmente entre 7-9): modula la carga de las moléculas. o Presencia de agentes desnaturalizantes: afecta a la forma (modificará su movilidad).  Soporte: se trata de la matriz donde se van a separar las moléculas → de agarosa (separación de DNA) o la poliacrilamida (separación de proteínas). o Restrictivo: restringe el movimiento de las moléculas por: carga/masa, forma, tamaño. o No restrictivo: carga/masa. Las proteínas en los geles de agarosa, como el DNA es mucho más grande que las proteína, el poro que se utiliza es mucho más grande que la mayoría de las proteína; de forma que a no ser que tenga interacción proteína-DNA (verás un retraso en la movilidad del DNA), las proteínas no se verán porque no tiene restricción y viajan en electroforesis libre. Electroforesis libre: movimiento de especies cargada en un campo eléctrico en disolución. Electroforesis zonal (normalmente): migran en ese soporte ubicándose en diferentes zonas de acuerdo a las propiedades específicas de la molécula. Así pues, hay muchos tipos de soportes, pero fundamentalmente veremos:  Geles de agarosa (almidón) → Restrictivos para DNA, no restrictivos para Proteínas.  Geles de poliacrilamida (PAGE) → Restrictivos para DNA y Proteínas. Movilidad electroforética relativa (Ur): distancia recorrida por una molécula problema respecto al Rf de las moléculas patrón. ( l c la r le a) r ( l c la atr n) Tienes un patrón (1ª columna) del que se conocen los pesos moleculares. De la molécula problema se deberá calcular el Rf, que no es más que la distancia recorrida por la molécula (desde el punto de inyección) respecto a la distancia del frente de iones.  El frente de iones esta normalmente marcado por el colorante del tampón de carga, ya que viaja con los iones que se desplazan desde el inicio de la electroforesis. 2. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS 2.1. GELES DE POLIACRILAMIDA (PAGE) Características: es inerte, transparente, estable, resistentes a agentes desnaturalizantes (urea y detergentes) y hay con gran variedad en el tamaño del reticulado.

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Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo La poliacrilamida está formada por dos polímeros diferentes, acrilamida y bisacrilamida. Estos dos se combinan entre sí y forman la red que nos va a limitar la movilidad de las proteínas y del DNA.  Para formar el soporte además de la mezcla de acrilamida, bisacrilamida y el tampón, se debe añadir persulfato y TEMED. Estos dos últimos se añaden al final, ya que desencadenan la reacción de entrecruzamiento (polimerización): esta catalizada por los radicales libres que se desprenden del persulfato (esto además es acelerado por el TEMED). La polimerización puede verse afectada por diversos factores: pH (ácidos son desaconsejados), la temperatura (a T más bajas la velocidad de la reacción varia) y el oxigeno molecular (inhibidor de la formación de estos radicales). Los geles de poliacrilamida tienen diferentes porcentajes: varían desde el 4% hasta el 18%:  Cambia la dureza. Ej: al 4% prácticamente no lo puedes coger, es muy bando.  Cambia la reticulación del gel ↓ % (poro mayor): separa moléculas grandes ↑ % ( r en r): se ara l c las eq eñas Gel de polimerización vertical que se da entre dos cristales. Hay dos cubetas separadas por el gel, donde se pone el tampón. Toda la intensidad de la corriente pasa a través del gel – va de una zona del tampón a la otra. No son geles totalmente sumergidos. (*) Los geles de agarosa son sumergidos, está completamente sumergido por el tampón, por tanto gran parte de la intensidad pasa por el tampón. Los iones van de un electrodo a otro, de forma que una parte atraviesa el gel y otra parte irá por tampón. Toda la intensidad de la corriente no pasa por el gel. 2.1.1. Detección de las proteínas  Tinciones (ordenados de menos sensible a más sensible): o Coomasie Blue (detecta banda entre 10-20ng de proteína), o Nitrato de plata, o Colorante fluorescentes (más caros, pero más sensible: detectas con menos cantidad de proteínas). (*) Las bandas bien definidas se ven a partir de los 100ng.  Actividad Enzimática (proteínas nativas): las proteínas catalizarán una reacción y se verá coloreado en función de su actividad, ya que el substrato está asociado a un colorante.  Marcaje radiactivo de las moléculas: las proteínas están se marcan radiactivamente al incorporar aa marcados, de manera que se puede hacer una auto-radiografía → el gel se expone en una placa fotográfica y lo que se emite (radioactividad emite energía) va a quedar marcado es esta placa.  Marcaje por detección inmunológica (Western Blot): una vez corrido el gel se incuba en un tampón de transferencia (tiene sobre todo metanol) y se pone en un equipo especial de electroforesis donde se aplicará un campo eléctrico que transferirá las moléculas del gel a la membrana. Esta se puede lavar y incubar con anticuerpo específico, de forma que se revelará y podremos ver aquellas banda donde se ha unido el anticuerpo.

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Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo 2.2. PAGE NATIVO Las proteínas no están desnaturalizadas, con lo cual conservan: estructura, actividad y carga. Estos geles nativos suelen ser geles continuos. Además la migración de las proteínas y no es solo por tamaño, sino que migran según la relación entre masa y carga. Se utilizan para comparar diferentes isomorfas de enzimas y como criterio de pureza. Ejemplo de tinción por actividad de lactato deshidrogenasa. Esta enzima tiene 4 subunidades y hay 2 isoformas, la de músculo (M) y de corazón (H), las cuales están en diferentes niveles en los tejidos. Las isoformas tienen el mismo peso molecular, pero se diferencian en el punto isoeléctrico. De forma que al ser un tetrámero, tenemos 5 posibilidad de combinación de M y H. Se diferenciaran en la movilidad en un gel nativo, porque aunque el tamaño es igual, la densidad de carga hará que la que esté más cargada será la que migre más. Se utiliza para ver las proporciones de estas isoformas en determinado tejido, en determinado momento, o en determinado individuo. Caso de utilización como criterio adicional de pureza. En la parte de purificación se dijo que una de las cosas más comunes era hacer una electroforesis en SDS y si había una banda la proteína estaba pura. Por el contrario, si hubiera dos bandas, esto nos puede estar indicando que hay un contaminante o una proteína con dos subunidades de pesos diferentes (sigue estando pura pero veo dos bandas). Si de manera complementaria a la electroforesis hago un gel nativo, lo que veremos si son subunidades diferentes de una misma proteína veremos una sola banda (porque no se desnaturalizan), pero si es un contaminante veremos dos bandas. 2.3. ELECTROFORESIS SDS Permite separar las proteínas exclusivamente por tamaño. Es una electroforesis de tipo desnaturalizante, porque tiene dos aditivos específicos:  2-mercapto etanol: reduce los puentes disulfuro → permite separación de las subunidades.  SDS: permite anular los factores carga y forma de la molécula, de forma que confiere la misma a todas las proteínas. Se trabaja en cantidades desnaturalizantes de SDS, de manera esta se une a lo largo de toda la proteína, las estira y las recubre → forma micela de carga (–): homogeniza carga y forma y vamos a poder separar únicamente por el tamaño. La mayoría de las proteínas que corren exactamente en su peso molecular. Pero hay proteínas muy cargadas (como la H1), en lugar de migrar a los 20kDa lo hace a los 30kDa porque la cantidad de SDS que se une no es suficiente para neutralizar todo la carga positiva de esta proteína; de manera que tiene movilidad electroforética aparente que es diferente a la que tendría si tuvieras en cuenta su peso molecular (caso puntal). Determinación del peso molecular Por eso se puede utilizar el SDS-page para determinar el peso molecular de una proteína desconocida. Hasta que no ha salido a espectrometría de masas había dos métodos para determinar el peso molecular de las proteínas: el SDS-PAGE y la cromatografía de filtración en gel. 4

Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo Es exactamente igual que lo que explicamos con la cromatografía de filtración en gel. Hay que tener patrón de molécula de peso molecular conocido para hace recta patrón y extrapolar esta para encontrar el log del peso molecular. La dependencia de la migración y el peso molecular es logarítmica, por tanto la diferencia de separación entre las bandas no es lineal. No tengo en el gel las bandas equidistantes, sino que a media que se va avanzando la separación es mayor entre las bandas porque guarda una relación logarítmica.

Se hace la recta de calibración de este estilo y obtenemos que la proteína problema tiene unos 35kDa. Si la misma proteína se analiza por filtración en gel obtenemos un peso de 140kDa. Las dos estimas son correctas, pero un uno miras el peso molecular de la subunidad y en otro el peso de la proteína. La conclusión es que tenemos un tetrámero (1 x4 → 35 · 4 = 140). Sistema discontinuo Normalmente se hacen dos geles para aumentar la precisión en la separación de las bandas, ya que como cargamos en un bolsillo de una altura determinada, esto puede hacer que las moléculas no entren todas al gel al mismo tiempo. Para asegurar una mayor eficiencia en la separación, el gel de arriba es un gel apilador – reunirá a todas la proteína entre los frontera de los geles, para que así todas entren al segundo el mismo tiempo. Este efecto se logra con el tampón, ya que el de la parte de arriba tiene un pH mucho más bajo (6.8) comparado con el tampón de corrida (8.6) → así se consigue que la glicina está parcialmente disociada y tenga baja conductiva. Efecto del apilamiento de la frontera en ambos geles: los iones cloruro se desplazan a elevada velocidad por el tampón de trislisina (tris equilibrado con ácido clorídico y glicina), de manera que las proteínas migran rápido hasta encontrar a este cloro. En la zona donde se junten se quedarán las proteínas frenadas hasta que llegue la lisina (se le ha bajado la conductividad y va lenta) y logré bajarlas.  El gel apilador no es restrictivo para el peso molecular las proteínas (tamaño de poro muy grande que no se opone al tamaño). Una vez que llegamos al gel inferior o separador, se cambia el pH de forma que la glicina pasa a estar disociada, se disminuye la diferencia de voltaje que se había creado en la frontera y entonces la glicina va por delante hasta el frente de iones y las proteínas ya se ubican en su peso molecular.

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Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo 2.3. ENFOQUE ISOELÉCTRICO (ELECTROENFOQUE) La separación es por el punto isoeléctrico de las proteínas. Se hace electroforesis a través de un soporte que tiene un gradiente de pH (Ej: de 6 a 9). Es electroforesis de equilibrio → las moléculas se mueven por carga y cuando llegue a su punto isoeléctrico se pararan. Se puede realizar en condiciones nativas o desnaturalizantes, dependiendo de la intención del procedimiento. Además, el porcentaje de acrilamida tiene que ser muy bajo (con poros muy grandes) para que no haya separación por masa. Se puede utilizar para determinar el punto isoeléctrico de una proteína y para hacer las electroforesis bidimensionales. Ejemplo: dos proteínas, una a pH 6 y otra a 8. Si cargamos en el centro del gel, una proteína migrara hacia un sitio y otra hacía otro en virtud de su carga. Migrarán hasta que se encuentren con su pI.

¿Cómo genero el gradiente de pH?  Anfolitos: poliamida pequeñas con grupos cargado que permiten grados de pI de 3 a 11. Es autogenerado, de manera que cuando preparas el gel y le añades la muestra, los anfolitos viajan más rápido que las proteínas y formarán el gradiente de pH.  Inmobilinas (Compuesto de diversos pH): co-polimeriza con la acrilamida, de manera que se prepara junto al gel y el gradiente ya está incorporado (no se ha de generar al cargar la muestra como el caso anterior). Normalmente el que se utiliza más es el de las inmobilinas, ya que se venden preparados. De manera que se podrá comparar entre diferentes laboratorio, y así los resultado son mucho más reproducibles. 2.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Recibe este nombre porque se separan las proteínas en dos dimensiones: una primera dimensión que realiza la separación en función del punto isoeléctrico (enfoque isoeléctrico) y una segunda dimensión en la que se separan por masa molecular (SDS-PAGE). Entonces, tenemos normalmente que el resultado es un gel que tiene valores diferentes de pH en el eje X y valores diferentes de peso molecular en el eje Y. En un gel como este, al utilizar dos principios de separación, podemos tener una mayor resolución de los componentes de una muestra. Se utiliza para caracterizar muestras complejas y en experimentos de 6

Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo proteómica → parte de la biología molecular que estudia el proteoma en diferentes condiciones y organismos: que proteínas son las que están expresada en un momento dado de desarrollo o en condiciones determinadas en organismo determinado.

Se pueden comparar geles bidimensionales y ver que como respuesta a diferentes tratamientos o enfermedad tenemos un aumento de proteínas. Por ejemplo, podemos a hacer un ensayo utilizando una droga que promueve la metilación del DNA, de forma que veremos luego que proteínas están aumentadas (comparas las células con el tratamiento y sin el tratamiento). La primera dimensión (pI) se puede hacer en condiciones desnaturalizantes o no, dependiendo del objetivo. A la segunda dimensión siempre es desnaturalizantes porque es un SDS-PAGE. A nivel experimental se cargan las proteínas en unas tiras y se hace el enfoque isoeléctrico, después esta se pone encima del gel SDS dónde se hace la separación. Normalmente después de las electroforesis las proteínas quedan en bandas, pero aquí al ser en 2D quedan como puntos debido a que no partimos de una mezcla homogénea, si no que esta focalizada → la banda cuando la muevas en una dirección se queda en un punto. También se puede utilizar como procedimiento complementario de pureza, de manera que se puede descifrar si las bandas que vemos de un mismo peso molecular, corresponden a una única proteína o a varias (ya que se distinguirían por el pI). Aunque es bastante complicado, ya que se requiere un equipamiento específico. 2.4.1. Differential gel electroforesis (DiGE) Este se diferencia de bidimensional normal en que se marcan diferentes muestras con fluoróforos distintos, de forma que se puede correr en el mismo gel los estándares y muestras distintas. Con esto consigues eliminar factores de variación que se dan entre geles distintos. Además, como puedes ir excitando a diferentes longitudes de onda e ir obteniendo imágenes diferentes, estas se pueden superponer luego y además trae incorporado un sistema de software para la normalización de cada uno de estos spot y la detección diferencial: permite decir si un spot está más representado en un lugar u otro. Nos permite ver una cuantificación relativa de las proteínas, de forma que en un mismo gen puedes cargar varias muestras y el control y hacer la cuantificación relativa de si hay sobreexpresión o disminución de la expresión en alguna de las muestras que has incorporado. 7

Grado de Genética – T.I. T.5 Gloria Hidalgo Protocolo general Primero se marca con los fluoróforos, se hace la separación por enfoque isoeléctrico, la separación en SDS y el scanning por separado y el análisis con software (análisis diferencial) → detecta los punto donde hay cantidades diferenciales de la muestra. Estos puntos son recortados del gel para analizarlos posteriormente mediante MasterPrice fingerprinting, en el que se digiere la proteína con un enzima proteolítico (generalmente tripsina) que corta después de los residuos básicos. Esta digestión se envía el espectrómetro de masas que calculará el peso de cada uno de esos péptidos → los resultados se meten en el software y se hace una búsqueda automatizada en las bases de datos. Con esto veremos la masa de los diferentes péptidos y cuales encajan con una digestión virtual de las proteínas que están en las bases de datos, permitiendo así la identificación de cada uno de los spots. Podemos hacer este tipo de trabajos de identificación de los spot en todos los spots del gel y así determinar todo el proteoma o se puede hacer el análisis después de un ensayo de marcaje diferencial y analizar solamente aquellos spots que están aumentados o disminuidos respecto al control.

3. ELECTROFORESIS DEL DNA 3.1. NATIVA Se realiza en geles de agarosa y la separación se da por tamaño (de moléculas lineales) y además por forma (válido cuando las moléculas no son lineales sino que depende de su conformación, como el caso de los plásmidos). La agarosa tiene varias propiedades interesantes: inerte, básicamente transparente (aunque a medida que aumentas el % cada vez lo es menos), resiste al pH, al T y a agentes desnaturalizantes. Además nos permite graduar el tamaño de poro.  Es importante decidir si queremos un gel más restrictivo o más laxo. La posibilidad de tener una flexibilidad del tamaño de poro es importante para la resolución. En la agarosa migran más rápido los fragmentos más pequeños. También es importante la concentración de agarosa, ya que si por ejemplo se encuentra en elevada concentración, se da mejor la separación de fragmentos pequeños, pero a menor concentración se...