Title | Tema 6. Dicroismo Circular (CD) |
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Author | Naishaky |
Course | Determinación Estructural |
Institution | Universidad de Castilla La Mancha |
Pages | 42 |
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Tema6 Dicroismo Circular(DC)
Circular dichroism (CD) spectroscopy measures differences in the absorption of left‐handed polarized light versus right‐handed polarized light which arise due to structural asymmetry. The absence of regular structure results in zero CD intensity, while an ordered structure results in a spectrum which can contain both positive and negative signals.
OndaEMpolarizadaenelplano verticalserepresentasóloel vectorE(enverde)
OndaEMpolarizadaenelplano horizontalserepresentasóloel vectorE(enrojo)
Tomadodehttp://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
2ondaspolarizadasenunplano,en fase(alcanzanpicosyceroalmismo tiempo)
Vector resultante luz polarizada en un plano pero a 45o respecto a los componentes iniciales
Tomadodehttp://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
2 ondas polarizadas en un plano pero desfasadas 90o (o ‐90o): una alcanza máximos (o mínimos) cuando la otra pasa por cero
derecha
izquierda
Vectorresultanterotaenun círculo=luzpolarizada circularmente Propagación de la onda resultante en espiral (no sinusoidal) Tomadodehttp://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
Luzpolarizadacircularmentealinteraccionarconmedioqueabsorbe
Luztrasmitidapolarizadatambiéncircularmente,perodemenorintensidad (menoramplitud,igualfrecuencia)
2ondaspolarizadascircularmenteaderechaeizquierda,delamismaamplitud
Vector resultante = luz polarizada en un plano Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
Luzpolarizadacircularmentealinteraccionarconmedioqueabsorbediferencialmentea izquierdayderecha
Noabsorbeluz polarizada circularmente aizquierda (rojo)
Absorbeluz polarizada circularmente aderecha (verde)
Luztrasmitidapolarizadaelípticamente
CDtransformaluzincidentepolarizadaenunplanoenluzpolarizadaelípticamente
Circulardichroism spectroscopy
Incident Light Emergent Light Differentabsorptionoftheleft‐ and righthandpolarizedcomponentleads toellipticity (CD)
Circulardichroism spectroscopy
A(λ)=AL(λ) ‐ AR(λ) =[L(λ) ‐ R(λ)] lC
A=absorbancia adeterminadaλ =coeficientedeextinciónmolar(M‐1 cm‐1) C=Concentraciónmolardelsolutoquiral l=pasoóptico
θ =elipticidad (medidaengrados,“deg”) [θ]=elipticidad molar(degcm2 dmol‐1)
tan
tan =
R L R L
=32.98. A A= .L.C
= L - R vsλ
[θ]=3.298,2 EspectrodeCD
Circulardichroism spectroscopy:Absorptionmicroscopy
‐ CD is only observed at wavelengths where absorption occurs, in absorption bands. ‐ CD arises because of the interaction between different transition dipoles doing the absorption. As this depends on the relative orientation of different groups in space, the signal is very sensitive to conformation. ‐ In general is much more conformation dependent that . ‐ Electronic CD of peptides and proteins appears below 240 nm. This region is dominated by the absorption of peptide bond and is sensitive to changes in secondary structure. ‐ CD in near UV correspond to side chains, visible to cofactors …..
Circulardichroism spectroscopy Moléculas ópticamentea ctivas Toda molécula que no dispone de un plano de simetría o centro de inversión. No es superponible con su imagen especular. La mayor parte de las moléculas sintetizadas por los organismos vivos son ópticamente activas
¿Aquésedebeelcomportamientorotatoriodemacromoléculas? Laestructuraprimariaesintrínsecamenteasimétrica Lasestructurassecundariasdemuchosbiopolímeros sonhelicoidales Laestructuraterciariadelamacromolécula
Circulardichroism spectroscopy PRINCIPALESCROMOFOROSENPROTEINAS Cromóforos enUV‐Vis
Espectros de dicroísmo circular Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las siguientes regiones de la radiación electromagnética: Ultravioleta cercano (250 ‐ 350 nm): grupos aromáticos de las cadenas laterales de triptófano, tirosina, y fenilalanina Ultravioleta lejano (180 ‐ 250 nm): enlaces amida que unen los residuos de los aminoácidos entre sí
OH O NH2
OH O NH2
El cromóforo Fenilalanina La cadena lateral de la Phe tiene un alto grado de simetría por lo que absorbe muy débilmente. El espectro tiene 4 bandas vibracionales que pueden ser positivas o negativas y tienen diferentes intensidades. En el espectro de CD de una proteína, la estructura vibracional de la Phe puede observarse cuando la proteína está plegada. El cromóforo Tirosina Las bandas son más intensas. Las bandas vibracionales tienen todas el mismo signo. OH En una proteína plegada, el espectro de absorción de este aa está compuesto por bandas anchas superpuestas, y el pico principal está a 276nm con un hombro a 283nm. La Tyr es capaz de formar puentes de H, lo que disminuye su energía de transición del estado fundamental al excitado y lleva un desplazamiento del espectro hacia el rojo.
OH O NH2
N H
Elcromóforo Triptófano El Trp absorbe mucho más intensamente que los otros aa aromáticos, sin embargo en una proteína suele haber más residuos de Tyr, por lo que la contribución de ambos al espectro suele ser similar.
El cromóforo Puente Disulfuro Este cromóforo resulta de la unión covalente de dos Cys de una proteína. Aunque la absorción de este enlace es débil, la intensidad de la banda en el espectro de CD puede ser fuerte. Sin embargo, la contribución al espectro de CD de este cromóforo está siempre bajo los cromóforos aromáticos. La contribución del cromóforo disulfuro al UV cercano es un pico que puede ser positivo o negativo, entre 250 y 300nm, sin bandas vibracionales distinguibles.
CDSpectraofProteinSecondaryStructures
hélice
Giros
+ Generalmentepredominalaformadelespectrodela ‐hélice n *bandanegativaa222nm (mínimo) *bandanegativaa208‐210nm (mínimo) *bandapositivaa190‐195nm (máximo)
/ Laproteínatieneunamezcladelosdosdominios. Elespectroessimilaralanterior.Ladiferenciaesquelabandaa222nmgeneralmente tienemayorintensidadquelabandaa208‐210nm
Proteínassinestructuraordenada (Random Coil)
SignalforaProteinDependsonitsSecondaryStructure
CDsignalsaresensitivetoSecondaryStructure
Proportionofsecondarystructures
ExampleFit:Myoglobin
ExampleFit:GCN4‐p1
CDSignalDependsonEnvironment
LimitationsofSecondaryStructureAnalysis
‐Hemolysin Structures
UsingCDtotestapeptidedesignedtobecontrolledbylight
UsingCDtotestapeptidedesignedtobecontrolledbylight
Circulardichroism spectroscopy
Ventajas: ‐Uso de poco material: 200 μLde 0.5 mg/mLde solución ‐Método no destructivo ‐Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T… ‐Desempeña un papel importante en la determinación de los componentes estructurales de las proteínas. ‐Es rápido y se puede utilizar para analizar un numero de proteínas candidatas a posteriores estudios estructurales más detallados como RMN y Rayos‐X. ‐Capacidad de detectar cambios estructurales en una proteína que ha sufrido alguna perturbación. ‐Comparación de estructuras manipuladas por ingeniería de proteínas frente a la especie nativa. Inconvenientes: ‐La absorbancia del solvente interfiere en la región de UV. Hay que trabajar con tampones muy diluidos y que no absorban a < 200 NM‐Medidas sujetas a errores experimentales ‐La determinación de los porcentajes de elementos de estructura secundaria no es realista. ‐Poca información de estructura terciaria o cuaternaria
CDAnalysis
Aplicaciones y usos de CD: • Determinación de la estructura 2ria de proteínas que no pueden ser cristalizadas. • Estudio de ligando • Estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T, solventes, etc. • Determinación de estructuras 2rias de proteínas de membranas (difíciles de cristalizar) y dentro de vesículas lipídicas (in vivo) • Estudio de interacciones proteína‐proteína y ácidos nucleico‐proteína. • Estudios de aspectos estructurales de: ácidos nucleícos, polisacáridos, péptidos, hormonas y otras moléculas pequeñas.
Fuentes de error: • Desviaciones y distorsiones en los espectros de estructuras típicas, sobre todo en las laminas que tienen espectros muy variables • La absorción de los aromáticos y puentes disulfuro. • Error al suponer que no hay interacción entre las estructuras 2rias (regla de aditividad) • Absorción del solvente: Hay que trabajar con buffers muy diluidos y que no absorban a menos de 200 nm.
ConsejosparaobtenerbuenainformaciónapartirdelespectrodeCD: • Primeroesnecesariocorrerunespectrodeabsorbancia normalparaverificarquelos valoresdeabsorbancia mantenganlinealidadsegúnlaLeydeBeer yverelrangode. • Todalaluzquelleguealaceldadebepasaratravésdelamuestra,nodebereflejarseen lasparedesobasedelacelda. • Generalmenteseusancubetascilíndricasyaqueestastienenmenosbirrefringencia (líneabasedeCD)yademásusanmenorcantidaddemuestra.Sinembargo,lasceldas rectangularessonmáseconómicasypuedenusarseparaespectroscopiadeabsorbancia porloqueelCDyelespectroestándarsepuedenhacerapartirdelamismamuestra. Ademásenestasúltimassepuedenhacertitulacionesseriadasyaqueenunprincipio puedellenarseun60%delacubetayluegoiragregandogradualmente. • Sedebetomarelespectrodelalíneabaseconelsolventeobufferyluegosustraerloal delamuestraparapoderobtenerelgráficofinal. • El espectro de CD generalmente escanea de de mayor a menor, por lo que se debe seleccionar un rango de que comience al menos 20 nm más allá que el que abarca la absorbancia normal.
Comparación de CD con UV‐VIS: • El dicroísmo circular y la espectroscopia UV‐vis son técnicas de espectroscopia de absorción electrónica basadas en el mismo proceso, el cambio de configuración electrónica molecular del estado fundamental a un estado excitado debido a la absorción de radiación electromagnética. • En el caso del UV‐vis se utiliza como fuente luz no polarizada, mientras que en los procesos dicroicos la luz está polarizada. • El dicroísmo circular mide la absorción diferencial de la luz polarizada circularmente hacia la derecha y hacia la izquierda....