TEMA 6 TÉ Cnicas DE DerivatizacióN Fluorescente Y Quimioluminiscente PDF

Preview

Summary

APUNTES...

Description

TEMA 6 TÉCNICAS DE DERIVATIZACIÓN FLUORESCENTE Y QUIMIOLUMINISCENTE

Fluorescencia Emisión de luz tras absorción de luz. SENSIBILIDAD. Sistema de detección de lo que esta ocurriendo en un sistema. Fosforescencia: se mantiene la emisión de luz durante un tiempo (aguja reloj) Ambas se pueden usar como sistemas de detección Medida de la fluorescencia 1. 2. 3. 4. 5.

Fluorímetros de filtros: ʎ de excitación y emisión concreta. Espectrofluorímetros Microscopios de fluorescencia Scanners de fluorescencia: en una superficie plana Citómetros de flujo: Detección en partículas que pasan por delante de un detector.

Metodología Aplicaciones al Bioanálisis: – Métodos directos: la molécula de interés es la que emite fluorescencia por si sola por ejemplo moléculas que son fluorescentes en función de su estado redox, si esta protonado o no como el NADH  NAD+ se puede ver el curso de la reacción con la presencia o no de la fluorescencia. 1. Biomoléculas fluorescentes por si mismas– Naturales o “sondas” 2. Monitorización de reacciones – Productos vs. reactivos fluorescentes – Métodos indirectos - Derivatización : se une una molécula fluorescente a la molécula que quiera y si mido esa molécula me dice lo que pasa. – Métodos de amortiguación (quenching): se mide mediante sonda fluorescentes y si ocurre alguna reacción que degrade a la molécula fluorescente o una desaparición o amortiguación de la fluorescencia. Fluoróforos naturales Fluorescencia directa: 1. 2. 3. 4.

Hidrocarburos aromáticos policíclicos Vitamina E ¡¡OJO: Vitamina A NO fluorescente!! Coenzimas (FAD, FMN, NADH) Carotenoides: excepto la vitamina A, ocurre un cambio de conformación de un doble enlace de cis a trans y gracias a este cambio se detecta la luz (esto pasa en los ojos). 5. Quinina (Gin Tonic) 6. Esteroides: solo algunos de ellos tienen los dobles enlaces conjugados y son susceptibles a fluorescencia. 7. Aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp)

8. Nucleótidos 9. Proteínas Fluorescentes (GFP - green fluorescent protein) Aplicaciones de la detección por fluorescencia • Estructura de proteínas: cuantificación para conocer la estructura 1. Directa (Phe, Trp, Tyr) 2. Indirecta • Propiedades de membranas – SONDAS fluorescentes capaces de atravesar los canales de las membranas. Características de las membranas: 1. Potencial 2. Transporte 3. Viscosidad • Reacciones enzimáticas 1. Desaparición de sustrato fluorescente 2. Aparición de sustrato fluorescente • Análisis de DNA 1. Directo 2. Indirecto: Aditivos Bromuro de Etidio/dihidroxinucleótidos unidos a una sonda que nos permite ver la fluorescencia sólo en estos. • Ingeniería genética • Immunoensayos • Proliferación celular y apoptosis Quimioluminiscencia Emisión de luz como resultado de una reacción química. LUCIFERASA: ATP + luciferina + O2 → AMP + PPi + CO2 + oxiluciferina + LUZ. La cantidad de luz que haya en el sistema nos dará una idea de la cantidad de ATP. Como la de las luciérnagas. IDEAL PARA la determinación de producción de ATP en un sistema celula, asi cuantifico ATP y la energía disponible en un sistema determinado. LUMINOL: Luminol + H2O2 → 3-aminoftalato + LUZ – Fe como catalizador. La forma más abundante es en la sangre. Luminol no es una molécula biológica, nos sirve para detectar la cantidad de hierro. Como en CSI. Pero puede dar falsos positivos (cuchillo de rabanos) Aplicaciones 1. 2. 3. -

Inmunoensayo (HRP-Ab + sustrato) Detección de hibridación de DNA Western blot acoplado a fluorescencia Otros Forense Análisis de alimentos: Pesticidas organofosforados...