Tema 6. Fotoperiodismo y floración PDF

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TEMA 3. Crecimiento reproductivo I. Fotoperiodismo y floración Introducción Hasta ahora lo que hemos visto ha sido crecimiento vegetativo, pero llega un momento en que las circunstancias ambientales determinan que este crecimiento vegetativo cambie a reproductivo. Los meristemos axilares comienzan un proceso de diferenciación para transformarse en meristemos florales. Hay especies vegetales cuya floración se da en días muy cortos, como es el caso de la flor de pascua, el arroz, la violeta africana, los almendros o las especies del género Prunus. Forman sus flores desde mediados de noviembre hasta mediados de enero. Las causas de la floración solían atribuirse exclusivamente a la percepción térmica, es decir, a la temperatura ambiente.

Sin embargo, en el 1920 Garner y Allard llevaron a cabo experimentos en invernaderos con plantas de Nicotiana a temperatura constante (20ºC) y modificaron el período de iluminación (fotoperíodo). El fotoperíodo de un invernadero era de 9 h de luz y el otro fotoperíodo era de 16 horas de luz. Observaron que estas últimas florecían, mientras que las sometidas a días cortos no florecían aunque la temperatura fuera de 20ºC. Los resultados no cuajaron en la comunidad científica del momento (estaban todos convencidos de que la temperatura era el único factor determinante) y tuvieron que esperar 15 años para que se tomaran en serio sus trabajos.

En este tema se mostrarán una serie de experimentos encaminados a explicar la influencia del fotoperíodo sobre la floración de los vegetales. EXPERIMENTO 30 Se ha empleado Glycine max (soja) para este experimento. La soja es una planta de día corto porque cuando se cultiva con un fotoperíodo de 9 horas seguido de un nictoperíodo de 15 horas, la planta florece. Si se someten a un fotoperíodo de 16 horas y un nictoperíodo de 8 horas, la planta no florece. El hecho de que sea una planta de día corto implica que tiene que tener algún mecanismo que le permita medir la cantidad de horas de luz o de oscuridad que hay en un día.

¿QUIÉN PERCIBE LA LONGITUD DEL DÍA? EXPERIMENTO 31 Se emplea de nuevo Glycine max, solo que esta vez se hace incidir durante el nictoperíodo luz roja durante 5 minutos. Se divide el nictoperíodo en dos subperíodos separados por un corto tiempo de iluminación con luz roja. Aunque la planta siga teniendo un nictoperíodo de 14h y 55 minutos no es capaz de florecer.

Al iluminar con luz roja lo que se intenta descubrir es si la floración responde a un fenómeno fotorreversible por mediación de fitocromo. Ahora se lleva a cabo el mismo experimento solo que tras los 5 minutos de luz roja se inciden 5 minutos de luz roja lejana. En estas condiciones la planta florece.

EXPERIMENTO 32 El mismo experimento es recreado con otra especie vegetal: Hyoscyamus niger. En este caso se somete a un fotoperíodo largo de 16 h y un nictoperíodo corto de 8 h. Se observa que la planta florece, al contrario que en el caso de la soja, por lo que se trata de una planta de día largo.

Ahora se interrumpe el fotoperíodo con 5 minutos de luz roja lejana y no florece. Una cierta proporción de Pfr revierte a Pr, y lógicamente llegará menos Pfr al final del fotoperiodo.

Se vuelve a repetir lo mismo con un primer pulso FR de 5 minutos seguido de otro pulso R. La planta florece.

¿POR QUÉ ESTÁ IMPLICADO FITOCROMO? Se procederá a explicar una serie de imágenes que ilustran los distintos tipos de luz que llegan a la superficie terrestre a lo largo de un día: Esta foto está tomada al amanecer, a las 5:00 de un día de julio. Se observan colores púrpura en el horizonte. Harry Smith desarrolló un espectrorradiómetro para medir intensidad luminosa a cada longitud de onda. Midió exclusivamente luz de 660 nm y luz de 730 nm; sale la razón R/FR, que mide cantidad de luz roja / cantidad de luz roja lejana. A las 4:00 la razón está por debajo de 1, por lo que hay mayor FR que R y conforme avanza el día la razón va aumentando hasta que supera la unidad.

A mediodía la cantidad de luz R es mucho mayor que la cantidad de FR. Al anochecer se invierten estas proporciones. La luz del atardecer mantiene durante ~30 minutos luz FR por encima de R, mientras que al mediodía la preferencia de R sobre FR queda patente. Las plantas pueden medir el tiempo que hay entre dos pulsos de FR. Si entre esos dos pulsos de FR hay luz, lo que mide es el día y si hay oscuridad estará midiendo la noche.

Las leyes de la difracción de luz son las que determinan estos patrones de longitud de onda. Cuando los rayos solares inciden sobre las capas superficiales de la atmósfera, estos se desvían según un ángulo que es tanto más acusado cuanto menor es la longitud de onda. Es decir, que sobre la vertical la luz violeta es la que más se desvía, después la azul, la verde etc. En una posición tangencial lo que más se desvía sigue siendo el violeta, seguido del azul, verde etc; sin embargo, la luz que alcanza con mayor intensidad es la del rojo lejano dando colores púrpuras.

Vertical

Tangencial

La luz lunar no tiene prácticamente ningún efecto sobre las plantas, ya que su espectro se corresponde a un aumento constante de cada una de las longitudes solares reflejadas por la La luz de las estrellas tampoco es relevante para la interacción con fitocromo. Solo hay un pico en el verde que no afecta en lo más mínimo a las plantas.

superficie lunar. De esta forma no hay variación significativa entre rojo y rojo lejano. Conclusión: fitocromo es el responsable de percibir si las noches o los días se alargan o se acortan. ________________________________________________________________________________ Para que la planta perciba que los días cambian sus horas de luz u oscuridad tiene que existir una longitud crítica del día. Esta longitud actúa como umbral por debajo del cual la planta percibe día corto y por encima del cual percibe día largo. A su vez, esa longitud crítica del día está genéticamente determinada y es diferente para cada una de las especies. En el caso de Glycine max, que tiene una longitud crítica de 10.5 horas, por encima ya consideraría día largo y por debajo día corto. Cada día es un ciclo inductivo: la planta va percibiendo que los días se van alargando y las noches acortando, y viceversa. No solo debe tener una longitud crítica determinada genómicamente, si no también debe ser capaz de percibir el número de ciclos inductivos y responder cuantitativamente. EXPERIMENTO 31 Se somete una planta cualquiera a una serie de ciclos inductivos y se observa el número de meristemos florales que se forman pasado cada ciclo. Al primer ciclo inductivo se forman 3 flores. En realidad las flores tardan más tiempo en aparecer. Lo que se cuantifica es el número de primordios florales observados a microscopía. Conforme va aumentando el número de ciclos inductivos aumenta el número de primordios florales. Se está cuantificando la respuesta floral en forma de primordios florales.

Ahora se lleva a cabo el mismo experimento solo que cuantificando la respuesta floral en porcentaje de floración frente a la longitud del fotoperiodo con 1 ó 3 ciclos inductivos. Con un solo ciclo inductivo aparece la primera respuesta floral entre 12 y 13 horas de luz. El máximo se consigue a las 15 horas de luz y 9 de oscuridad. Con tres ciclos inductivos la cantidad de luz necesaria para iniciar la respuesta floral es menor que en el caso anterior presentando respuesta a las 11 horas de luz. Con un ciclo inductivo la longitud crítica del día es mayor que con más de uno.

¿CÓMO SE EXPLICARÍA EN TÉRMINOS DE FOTOCONVERSIONES DE Pr EN Pfr? Se lleva a cabo un experimento con una planta de día corto: Glycine max. 9h

15 h Florece

No florece R Florece RFR Las plantas de día corto necesitan un nictoperiodo lo suficientemente largo como para revertir el máximo de Pfr a Pr si quieren florecer. Por esto mismo, cuando se aplica un pulso de luz roja a 7.5 horas del inicio del nictoperiodo la planta no florece porque al final de la noche tiene Pfr en cantidades superiores a las normales. Cuando se aplica un pulso de luz roja lejana, el efecto de la luz roja revierte y el Pfr se transforma de vuelta en Pr (la planta florece). En una planta de día largo como Hyoscyamus niger ocurriría algo similar: 16 h

8h Florece

No florece FR Florece

•

Conclusión: Pfr tiene un papel inductor de la floración en plantas de día largo y un papel inhibidor en plantas de día corto. Los días cortos coinciden con mínimas intensidades lumínicas, mientras que los largos lo hacen con máximas. Esto tiene sentido cuando se conoce el mecanismo de fotoconversión de Pr en Pfr que se ha estudiado en el tema de fitocromos.

¿LA PERCEPCIÓN DEL ESTÍMULO FLORAL ES TRANSMISIBLE? En el anterior tema se hizo un experimento que mostraba la diferencia de potencial entre dos regiones, una región apical limitada al espacio estanco de un cuerpo negro y la región basal expuesta al medio externo. Las posibles moléculas solubles que pueden ser transmitidas de célula a célula se han ido probando una a una durante muchos años, pasando por hormonas animales, vegetales y demás compuestos sin resultados concluyentes sobre la floración. Sin embargo, en el 2003 se consiguió dar con un compuesto capaz de inducir floración, la putrescina.

La putrescina es la 1,4-diaminabutano, producto del catabolismo de la arginina que se sintetiza en las hojas de la planta y migra hacia los meristemos apicales y axilares para inducir la floración. EXPERIMENTO 32 Se trabaja con una planta de Glycine max (planta de día corto). La hoja basal (más vieja) se mantiene bajo condiciones de luz y el resto de la planta en oscuridad. Al cabo de una serie de fotoperiodos largos y cortos se mide la cantidad de putrescina acumulada en el meristemo apical y en la hoja basal. Meristemo apical

Hoja basal

Gráfica de hoja basal

Gráfica de meristemo

Durante el período de transición entre el día 0 y la noche del primer ciclo inductivo corto (círculo negro) se observa en la hoja basal una disminución de putrescina equivalente a 40 nmol por gramo de peso fresco. En el meristemo lo que se observa es un aumento de la putrescina en 33-34 nmol g-1 de peso fresco. Durante los ciclos no inductivos de día largo (cuadrados rojos) no se producen cambios en los meristemos vegetativos y los niveles de putrescina en el meristemo apical permanecen invariables. Si nos volvemos a centrar en los ciclos inductivos de día corto donde sí hay variaciones en los niveles de putrescina y sí hay respuesta floral (cambio de meristemos vegetativos a florales), se puede deducir que una cantidad de putrescina de la hoja basal está siendo transportada hacia el meristemo apical. Sin embargo, la variación en el meristemo apical podría deberse a otra causa distinta que la luz recibida en la hoja basal.

Para evitar confusiones se plantea otro experimento con el mismo protocolo solo que empleando putrescina exógena marcada radioactivamente con 14C. Se mezcla la putrescina marcada con vaselina y se unta sobre la nervadura de la hoja basal, se deja el tiempo necesario para que penetre en los vasos conductores de la hoja y se aplican los ciclos inductivos:

Con ciclos inductivos de día corto la cantidad de putrescina marcada en el meristemo apical da un pico de máxima concentración en la transición de la primera noche inductiva al primer día inductivo. Como la planta no sintetiza putrescina 14C, solo puede proceder del punto de aplicación a nivel de la hoja basal.

La putrescina ha sido movilizada hacia los centros de respuesta floral (meristemos no sometidos a condiciones de fotoperiodo inductivo) desde otro órgano que sí ha estado expuesto a fotoperiodos inductivos. ACCIÓN DE LA PUTRESCINA La putrescina asegura la polimerización completa de los mRNAPoliA. Estos mensajeros PoliA son mensajeros reguladores, concretamente son silenciadores de genes. Por lo tanto, la hoja basal del anterior experimento estaría movilizando un regulador de la expresión génica hacia los centros de respuesta floral. La putrescina puede actuar como catión y como tal puede ser movilizado dentro de un campo eléctrico cuando existen diferencias de potencial entre dos regiones distintas.

PAPEL DE LA LUZ AZUL SOBRE LA FLORACIÓN En el espectro de mediodía se observaban tres picos de absorbancia a tres longitudes de onda diferentes: 660 nm (absorción de Pr) a 730 nm (absorción de Pfr) y a 480 nm (región del azul, absorción por otra clase de fotorreceptor). Se pensó que la luz azul podría jugar un papel importante en la floración de plantas de día largo, por el simple hecho de que están sometidas a largos fotoperíodos. EXPERIMENTO 33 Los primeros experimentos realizados al respecto se hicieron con la especie Sinapis alba, un vegetal de día largo. Las plantas de mostaza blanca son sometidas a ciclos inductivos con diferentes tipos de luz. Los dos tratamientos son los siguientes: • Luz roja de 660 nm. • Luz roja de 660 nm + Luz azul de 480 nm. Al final de cada tratamiento se mide la floración en porcentaje respecto del máximo floral específico de especie.

En el primer ciclo inductivo la planta de mostaza no muestra diferencias significativas entre los dos tratamientos. Cuando aumenta el número de ciclos inductivos comienza a haber diferencias significativas entre las plantas que son tratadas exclusivamente con luz roja y las que son tratadas con roja y azul.

El fitocromo no es capaz de absorber longitudes de onda azules al ser un tetrapirrol lineal como ya quedó patente en el tema de fitocromos. Por lo tanto, tiene que existir otra molécula que sí sea capaz de absorber dichas longitudes. Las flavinas no sirven tampoco para este fin y pasado un tiempo y a raíz de diversos estudios que pretendían dilucidar la naturaleza del compuesto se le comenzó a llamar con el nombre de Criptocromo (del griego = color escondido). El criptocromo es la supuesta molécula capaz de absorber longitudes comprendidas entre los 470 – 490 nm y que tiene un efecto sobre la floración. No fue hasta 2005 que se descubre que el criptocromo era una DNA fotoliasa prácticamente idéntica a la que desarrollan las bacterias para evitar degradación de DNA por luz ultravioleta. Estas DNA fotoliasas vegetales tienen dos dominios flavínicos distintos a los de la fototropina: los dos cromóforos son distintos, se trata del meteniltetrahidrofolato (MTHF) y la deazaflavina (8-HDF). Se trata de una flavoproteína de naturaleza enzimática capaz de romper el DNA, salvo que en este caso los criptocromos son citoplásmicos y no tienen acceso al material nuclear. No se conoce con exactitud la forma de actuación de criptocromo, sin embargo existen varias teorías al respecto:

SOLUCIONANDO EL PROBLEMA FINAL

Los cromóforos de criptocromo actúan secuencialmente. Primero MTHF absorbe un fotón de luz azul, excita un par de electrones de su estructura y transfiere la energía de excitación hacia la deazaflavina. La deazaflavina excitada cede su electrón a otro compuesto que se desconoce a día de hoy. Podría ser un residuo de histidina de la porción proteica de criptocromo, o bien un sustrato redox desconocido o un cromóforo externo. La deazaflavina se oxidaría y volvería a su estado basal absorbiendo otro fotón azul. Lo que sí se sabe es que el efecto final es promover la floración en plantas de día largo.

Lo que se falta por demostrar es cómo un meristemo de crecimiento vegetativo pasa a ser meristemo de crecimiento reproductivo. El desencadenante del cambio de transición entre crecimiento vegetativo a crecimiento reproductor es un gen: Constance (CO). CO es activado por fitocromo y promueve la expresión de otras dos proteínas responsables del cambio. En resumen, fitocromo junto a criptocromo se activan con luz roja y azul, respectivamente; activan una cascada de genes que termina por inducir la expresión del gen CO. El cambio de expresión en las células del meristemo foliar de crecimiento vegetativo induce su diferenciación en células del meristemo floral.

Muchos estudios van encaminados a tratar de completar las rutas de expresión de genes partícipes del proceso de floración, y experimentos con Arabidopsis thaliana sacan varias conclusiones. EXPERIMENTO 34 Laura Ribas, científica española, diseñó un experimento con Arabidopsis thaliana en el que puso de manifiesto el papel de los micro RNAs (miRNA) con función inhibidora, que ya se han comentado previamente y cuya expresión es promovida por la putrescina. La putrescina facilita la poliadenilación de miRNAs nucleares que inducen la expresión de una serie de proteínas que forman un complejo DICER. Este complejo rompe mRNAs citoplásmicos formando pequeños RNAs (siRNA), otro tipo de miRNA. Escogió mutantes para un gen concreto que impide la floración, el gen argonauta (ago). Dicho gen expresa una proteína que forma un complejo con los siRNAs inducidos por la putrescina, el complejo RISC. La secuencia del siRNA hibrida con aquellos mRNAs que presenten homología con su secuencia nucleotídica, acoplándolos al complejo RISC para que uno de sus integrantes corte el mRNA degradándolo (concretamente AGO). Mutantes deficitarios en ago no florecen y aquellos mutantes a los que se les aplica un splicer ó rebanador consiguen florecer. El papel del splicer consiste en recrear la misma función que la proteína AGO formando el mismo complejo RISC.

Al final los mRNAs de crecimiento vegetativo son degradados y se promueve la expresión de los genes florales. GENES QUE PARTICIPAN EN LA FLORACIÓN

Cuando fitocromo-B y criptocromo absorben luz, activan el gen Co, cuya proteína actúa como inhibidor del gen Tfl1 (este gen codifica para proteínas de crecimiento vegetativo). Otros genes asociados, como el Flc que percibe el frío, están implicados en la floración de algunas especies como el caso de las gramíneas bianuales. La proteína FLC induce el gen Soc1 (supresor de la sobrexpresión del gen constance). Los genes autónomos responden a factores hormonales (tales como giberelinas, poliaminas, etc), como el caso del gen Fld y también inducen la expresión del gen Soc1. Por lo tanto hay muchos genes que confluyen en rutas de transcripción semejantes en función de los factores ambientales y endógenos de la planta: luz, temperatura y hormonas endógenas; principalmente. Estos genes son los llamados genes de integración, ya que integran mucha información para que la respuesta de la planta sea floral y no vegetal. La proteína SOC1 induce la expresión de los genes de identidad del meristemo floral. Los genes Lfy1 y Ap1 codifican para sus respectivas proteínas que se encargan de cambiar irreversiblemente la identidad del meristemo vegetal en meristemo floral. Si estos genes se pierden por deleción, por ejemplo el Lfy1, se forman inflorescencias estériles en el lugar axilar donde la flor se debía diferenciar si tuviese el gen activo. Si se deleciona el gen Ap1 se forman inflorescencias estériles sobre el limbo foliar de la hoja. Ahora del meristemo floral se tienen que diferenciar capas para dar cada uno de los verticilos de la flor. Para ello se precisan genes de identidad del órgano. Los genes catastrales (Sup) actúan organizando la posición de cada verticilo en el espacio y los genes de identidad del órgano floral se organizan a su vez en cajas (A, B y C).

En este diagrama se muestran las tres cajas ABC que presuntamente organizan cada uno de los verticilos. Para relacionar la caja con su verticilo se realizan experimentos con mutantes.

Las conclusiones de este experimento son bastante sencillas: • Mutación de los genes de clase A: la caja C ocupa el lugar dejado por la caja A y sólo aparecen estambres y carpelos. Podemos deducir que la caja A forma sépalos y pétalos. • Mutación de los genes de clase B: no hay reocupación de la posición dejada por B y aparecen sépalos y carpelos. La caja B podría formar estambres y cooperar con A para formar los pétalos. • Mutación de los genes de clase C: hay reocupación por A del espacio dejado por C y aparecen sépalos y pétalos. La caja C formaría los carpelos y en co...