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 TEMA 8: CENTRIFUGACIÓN 

Maika Fernández Delgado 1º Biotecnología               

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1. CENTRIFUGACIÓN La centrifugación es una técnica que permite la separación de partículas, basándose en su capacidad de sedimentación. Esta técnica se basa en el efecto de la gravedad sobre partículas en suspensión con diferentes masas, que se depositarán (sedimentarán) a velocidades diferentes. Cuando se emplea esta técnica, la sedimentación de las partículas es acelerada gracias al uso de la fuerza centrífuga, que se aplica para incrementar la velocidad de sedimentación mediante un instrumento llamado centrífuga. Se utiliza para separar o concentrar materiales disueltos o suspendidos en un medio líquido y se aplica al análisis o a la separación de mezclas de partículas, incluyendo células, orgánulos y moléculas. Siempre precipita antes lo que está en suspensión, que lo que está disuelto en el disolvente.

2. TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN Según la velocidad de centrifugación: a) Centrifugación a baja velocidad (menos de 10.000 rpm). Ej: sustancias en SUSPENSIÓN b) Centrifugación a alta velocidad (entre  10.000 y 20.000 rpm). Ej: proteínas DISUELTAS c) Ultracentrifugación (más de 20.000 rpm). Ej: proteínas DISUELTAS Según el objetivo: a) Centrifugación analítica. Se utiliza para medir las propiedades físicas de las partículas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentación o su masa molecular (normalmente ultracentrifugación analítica). b) Centrifugación preparativa. De uso más común, se utiliza para aislar partículas para su análisis o utilización posterior. En general, requiere mayor cantidad de muestra que en la analítica.

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3. FUNDAMENTOS DE LA CENTRIFUGACIÓN La velocidad a la que se mueven los distintos componentes de una muestra bajo la acción del campo centrífugo determina la separación. Tubo lleno de moléculas diferentes, las cuales tienen distintas velocidades de distribución. Al centrifugar obtenemos fracciones enriquecidas. La velocidad de sedimentación (y, por tanto, el mecanismo de la separación) depende de su tamaño, densidad y forma (mientras más densa sean las sustancias, moléculas, etc antes llegaran al fondo); todos estos parámetros se combinan en el coeficiente de sedimentación, que se mide en unidades svedberg (1S = 10−13 segundos). de sedimentación  velocidad Coeficiente de sedimentación = S = aceleración centríf uga

Los coeficientes de sedimentación no son aditivos, debido a que dependen tanto de la masa, como de la forma que tenga la molécula. P. ej., el coeficiente de sedimentación de los ribosomas eucarióticos (dos subunidades, 60 S y 40 S) es 80 S (no 100 S). 60S tiene n nº de interacciones, esa interacción con el medio líquido (buffer) deja de existir al unirse al 40S que tb tiene interacciones que pierde, por eso se dice que son son aditivos. Los factores de los que depende la velocidad de sedimentación van a permitir diferentes modalidades de centrifugación: a) Centrifugación diferencial b) Centrifugación zonal o de velocidad de sedimentación c) Centrifugación isopícnica o de equilibrio de sedimentación  4. CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL La muestra va a ocupar la totalidad del tubo de forma que, al aplicar el campo centrífugo, los componentes con mayor S avanzarán a mayor velocidad y alcanzarán antes el fondo del tubo. Se obtienen sólo 2 fracciones: sedimento (componentes que han alcanzado el fondo) y sobrenadante (componentes que permanecen en disolución o suspensión). Para separar más de dos componentes de una muestra, la centrifugación diferencial se suele desarrollar en varias etapas, aplicando campos centrífugos crecientes y duraciones cada vez mayores (proceso de fraccionamiento diferencial). Una aplicación típica es el fraccionamiento subcelular (separación de los distintos componentes de una célula, principalmente los orgánulos), empleando sucesivas centrifugaciones a velocidad creciente.   

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  5. CENTRIFUGACIÓN ZONAL La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de centrifugación, que debe tener una densidad superior a la de la muestra (“colchón”). En él, las partículas se separan en función de su velocidad de sedimentación. Lo más habitual es emplear medios de centrifugación cuya densidad aumenta hacia el fondo del tubo (gradiente de densidad), para reducir las corrientes de convección. Bajo la fuerza centrífuga, las partículas sedimentan a través del gradiente en función de su coeficiente de sedimentación (S), concentrándose en zonas o bandas discretas. (Las moléculas se van a separar por zonas (en bandas) en función de si scoeficiente de sedimentación) El gradiente de densidad se crea generando un gradiente de concentración, con concentraciones crecientes hacia el fondo del tubo. Para generar el gradiente de densidad, se pueden emplear sustancias muy diferentes, cuya elección va a depender de diferentes factores (los límites de densidad que precisa la separación, la sensibilidad de los componentes de la muestra a la fuerza iónica o a la presión osmótica, la facilidad para separar la sustancia de la muestra tras la centrifugación, el coste, etc.). Los gradientes de densidad se pueden dividir en dos grupos: discontinuos y continuos. a) Gradientes discontinuos o escalonados, manualmente. b) Gradientes continuos preformados, empleando un sistema formador de gradientes. c) Gradientes continuos autogenerados, se generan mediante centrifugación (normalmente a la vez que se fracciona la muestra).

La centrifugación termina antes de que las partículas con mayor S lleguen al fondo del tubo. Los componentes separados se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas, o perforando el fondo del tubo y recogiendo en fracciones el líquido que cae.

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Con una sola centrifugación separa varias sustancias, depende de la masa y S (densidad, tamaño)

Centrifugación zonal. A. Preparación de un gradiente continuo de densidad. B. Aplicación de la muestra sobre el gradiente. C. Colocación de los tubos en un rotor basculante y centrifugación. D. Recogida en fracciones de los componentes separados.

Un caso particular de la centrifugación zonal serían los métodos de barrera. Son métodos rápidos, típicos por ejemplo en la obtención de leucocitos libres de sangre periférica del resto de células sanguíneas. Se trata de una centrifugación a través de un medio de densidad constante que se podría considerar como un gradiente discontinuo de una sola capa. La densidad de este lecho debe ser intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean medios comerciales, formados generalmente por mezclas de Ficoll (un polisacárido sintético) y metrizamida (un compuesto sintético yodado). Existen diferentes medios con densidades adecuadas para la separación de tipos celulares concretos.

  6. CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA Se trata de una centrifugación de equilibrio que separa por diferencias de densidad. Se utiliza también un gradiente de densidad, pero en este caso el tiempo de centrifugación es lo suficientemente largo (hasta  48h) como para que se alcance el e quilibrio de sedimentación. Se suele llevar a cabo en gradientes autogenerados que cubren todo el intervalo de densidades de los componentes de la muestra: en el fondo del tubo la densidad del medio ha de ser 4

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mayor que la del componente más denso. De esta forma, independientemente del tiempo de centrifugación, las partículas nunca sedimentan en el fondo, sino que alcanzan una posición estable intermedia en el gradiente, donde se concentran en una banda muy estrecha (mejor resolución). Puede desarrollarse de modo que la aplicación de la muestra sea zonal, pero lo más frecuente es mezclar la muestra con el medio que formará un gradiente autogenerado (habitualmente sales de metales alcalinos como CsCl) a la vez que se hace la separación. Requiere velocidades muy altas (ultracentrifugación) para que se forme el gradiente. Además de la mayor resolución, lo interesante de esta técnica es que separa exclusivamente según la densidad de los componentes de la muestra, que se sitúan en la posición del gradiente donde la densidad del medio es igual a la suya propia (isopícnica = de igual densidad, en griego). NO EXISTEN S en centrifugación isopícnica, solo miramos densidades. Densidad del medio iguale a la densidad de la molécula.  7. INSTRUMENTACIÓN El aparato en el que se desarrolla una centrifugación recibe el nombre genérico de centrífuga. Existen diferentes tipos de centrífugas: 1) Centrífugas de baja velocidad. Económicas y que giran hasta una velocidad de 5000 rpm. Pueden sedimentar (separar) células, pero no orgánulos o biomoléculas. 2) Microcentrífugas. Giran hasta 14.000 rpm, velocidad suficiente para sedimentar y separar ácidos nucleicos y proteínas. Son empleadas con volúmenes pequeños de muestra. 3) Centrífugas de alta velocidad. Giran hasta velocidades de 25.000 rpm, suficiente para separar orgánulos y biomoléculas. Son refrigeradas. 4) Ultracentrífugas. Alcanzan velocidades del orden de 100.000 rpm, suficiente para fraccionar biomoléculas, por ejemplo, DNA plasmídico, DNA cromosómico y RNA. También son refrigeradas, muy caras y muy delicadas en su manejo.

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Una ultracentrífuga consta de varios componentes básicos: a) Rotor. Recipiente giratorio para contener los tubos de centrifugación con las muestras. b) Motor. El rotor va a estar sometido a una rotación generada por un motor y que se transmite a través de un vástago. c) Cámara blindada. El rotor ha de girar en una cámara a presión reducida, para facilitar la función del motor y disminuir el calentamiento por rozamiento con el aire. Asimismo, debe estar termostatizada para poder efectuar el análisis a una temperatura controlada ya que, al no poder trabajar a un vacío absoluto siempre se produce cierto rozamiento. Y debe estar blindada para prevenir posibles accidentes derivados de una rotura del vástago. d) Sistema de vacío. Reduce la presión en la cámara en la que gira el rotor. e) Sistema de refrigeración. Mantiene la temperatura controlada en el interior de la cámara blindada. Tipos de rotor a) Rotor fijo o angular. Con forma de tronco de cono y varias perforaciones que alojarán los tubos de muestra formando un cierto ángulo con la vertical (de ahí su nombre). Admiten un gran volumen de muestra (más de 5L). b) Rotor vertical. Con forma de cilindro y varias perforaciones verticales para contener los tubos de muestra. Permiten una sedimentación más rápida. c) Rotor flotante o basculante. Con forma de seta, del sombrerillo cuelgan unas carcasas metálicas en cuyo interior se alojan los tubos de muestra. Cuando comienza a actuar el campo centrífugo, las carcasas se orientan a favor del campo, pasando a estar colocadas perpendicularmente respecto a la posición de reposo.

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Rotores Los rotores habitualmente tienen una apariencia robusta, por ser pesados y metálicos. Sin embargo, deben manejarse con gran precaución y deben estar perfectamente equilibrados antes de comenzar a girar, ya que el más mínimo desequilibrio es muy peligroso cuando están actuando campos centrífugos elevados: Un desequilibrio de 1 mg se convertiría en 0,5 Kg cuando se aplica un campo centrífugo de 500.000 g. Un giro descompensado del rotor con esta fuerza podría provocar la rotura del fino vástago, lo que implica un enorme peligro (el pesado rotor podría salir disparado de la centrífuga). Se debe respetar estrictamente el límite de campo centrífugo que pueden soportar (si no, se pueden producir fracturas en el metal, que podrían conducir a la desintegración del rotor cuando se esté utilizando). Es necesario extremar su limpieza, ya que si quedan restos de las muestras centrifugadas y no se eliminan con un tratamiento suave, pueden aparecer zonas de corrosión en el rotor, que pueden llegar a inutilizarlo si quedara desequilibrado.

Tubos de centrifugación

8. RESUMEN CENTRIFUGACIÓN  

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9. ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA El objetivo de los procesos analíticos de ultracentrifugación es la determinación de parámetros físicos de las partículas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentación o su masa molecular. También se puede utilizar para evaluar el grado de pureza de una muestra. Una ultracentrífuga analítica necesita, además de los mismos componentes que una preparativa, un sistema de observación que permita estudiar lo que le sucede a la muestra durante la aplicación del campo centrífugo. Las moléculas se observan mediante un sistema óptico durante la centrifugación, por lo que los recipientes para muestras (llamados en este caso celdas de centrifugación) deben ser de cuarzo, material transparente a la luz visible y ultravioleta. Se emplean rotores basculantes y la observación se realiza en sentido vertical. Los sistemas ópticos de análisis pueden ser de tres tipos, dos de ellos efectúan un análisis de tipo refractométrico (sistema óptico de schlieren y sistema óptico interferométrico) y el tercero lleva a cabo medidas de absorbancia (sistema óptico de absorción). Estos sistemas de análisis permiten determinar la velocidad de desplazamiento del soluto bajo la acción del campo centrífugo, calcular densidades de flotación y conocer la distribución de concentraciones del soluto en la célula de centrifugación cuando el sistema ha alcanzado el equilibrio (en los experimentos  de centrifugación de equilibrio). 

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