Gaschromatografie-2 - samenvatting onderdeel gaschromatografie PDF

Preview

Summary

samenvatting onderdeel gaschromatografie
...

Description

Farmaceutische Analyse II: Gaschromatografie

1. INLEIDING → Ontdekt in jaren 50 (10 jaar na de ontdekking van vloeistofchromatografie) ➢ Grote impact in analytische scheikunde ➢ Direct toegepast in petroleumindustrie van toen ➢ Nu toepassingen in analytisch, farmaceutisch en forensisch onderzoek Gaschromatografie = chromatografie waarbij een monster met daarin de te scheiden analieten in gasfase wordt gebracht ⇒ Chromatografie met MF in gasvorm ➢ Temperatuur zal belangrijke rol spelen → 2 vormen (afh vd stationaire fase) Gas-liquid partition chromatography ○ SF is een niet-vluchtige vloeistof gebonden aan de binnenwand van de kolom (capillair) of aan inerte vaste deeltjes in de kolom (gepakt) → Meest voorkomende vorm Gas-solid adsorption chromatography ○ Directe adsorptie en desorptie van het analiet aan vaste partikels van de SF Eigenschappen van de stationaire fase is van belang: (deze bepalen de interacties met analieten) ➢ oplosbaarheid/adsorptiekracht van de analieten ➢ Polariteit van de analieten en SF ➢ Chemische interacties 1. GC OPSTELLING EN INSTRUMENTATIE Injectie Mengsel van analieten opgelost in een vluchtig solvent (vb ethylacetaat, kan makkelijk in gasfase gebracht worden) ➢ Wordt geïnjecteerd in het septum = rubberen membraan in een verhitte kamer ➢ Zo wordt alles in gasfase gebracht ➢ De MF is ook in gasfase en neemt het mengsel mee & stuurt dit in de kolom Scheiding ➢ Kolom wordt op een bepaalde temperatuur gehouden ➢ Analieten condenseren in een smalle band aan het begin vd kolom

1

➢ Temperatuur in de kolom wordt opnieuw verhoogd → Analieten komen 1 voor 1 weer in gasfase ⇒ Scheiding van analieten door verschil in kookpunt & verschillende interacties met SF Detectie Detector wordt op bepaalde T gehouden zodat abalieten in gasfase blijven (GEEN condensatie) 2. NADELEN VAN GC Een aantal stoffen kunnen niet gebruikt worden in GC ➢ Geen thermolabiele analieten (omw van hoge temperaturen) ➢ Geen Niet-vluchtige componenten ○ Oplossing = derivatisatie → inplanten van chemische groepen die vluchtigheid verhogen ➢ Geen macromoleculen en zouten 3. CHROMATOGRAM → Retentietijd = geeft info over de identiteit van het analiet (vgl met referentiestandaard) → Piekoppervlakte = hoeveelheid van het analiet in het monster 2. GC KOLOMMEN → 2 grote groepen van kolommen, de gepakte kolom en de capillaire kolom waarbij de capillaire kolom wordt het meeste gebruikt. 1. GEPAKTE KOLOMMEN = Een holle cilinder van 1-10 m lang met een interne diameter van 2-6 mm, gemaakt uit roestvrij staal of glas ➢ Gevuld met kleine partikels (100-250 µm) ○ Gecoat met niet-vluchtige stationaire fase (vloeibare SF) = verdelingschromatografie OF ○ De partikels zelf zijn de stationaire fase (vaste SF) = adsorptiechromatografie Gas-solid chromatography partikels: ➢ Alumina (Al2O3) of bepaalde polymeren Gas-liquid chromatography partikels: ➢ Silica/silicagel (zwak zuur SiO2) dat bewerkt wordt ➢ Vrije silanolgroepen ➢ Silanisatie: inactiveerd de silanolgroepen → vermindert de polariteit van SF (worden afgeschermd met apolaire groepen) → De SF zelf wordt bereid door de silicapartikels te mengen met een niet-vluchtige vloeistoffase (silica is een soort drager van de vloeibare SF) ➢ Vloeistof bepaalt karakter van SF

2

➢ Moet thermolabiel zijn

Toegepast op van Deemter Factor A, Eddy diffusie: Aanwezig ➢ Hoe kleiner de partikels, Hoe beter de resolutie en efficiëntie ( → vermindering factor A) ➢ Kleine partikels en een langere kolom → hoge tegendruk voor MF (maar een beperkt debiet mogelijk) Factor B & C ook aanwezig Voordeel: Er kan erg veel staal geïnjecteerd worden → wordt gebruikt bij preparatief werk Nadeel: Brede pieken en slechte resolutie door een minder gunstige R en N 2. CAPILLAIRE KOLOMMEN = De meest belangrijke en meest gebruikte kolom langer (15-100m) en smallere diameter (0,10-0,53 mm) dan de gepakte kolom. = ‘open tubular’ kolom → open, niet gevuld ➢ Gemaakt uit ‘fused silica’ aan de buitenkant gecoat met polyimide polymeer ○ silica stabiel houden & beschermen ➢ Binnenkant gecoat met eigenlijke stationaire fase + chemisch behandeld zodat vrije silanolgroepen geïnactiveerd worden Toegepast op van Deemter Factor A, Eddy diffusie Deze factor valt weg ⇒ Open kolom, dus geen verschillende wegen doorheen de kolom Factor B, Longitudinale diffusie Deze factor daalt ⇒ Door hoge debieten die we kunnen creëren omdat er geen tegendruk is Factor C, Massatransfer Deze factor daalt ⇒ Kolommen met kleine interne diameter en dunne SF ⇒ snelle uitwisseling tussen MF & SF Voordelen: ➢ Druk veel lager dan in gepakte kolom ➢ Er kunnen langere kolommen gebruiken met hoger debiet ➢ Kleine plaathoogte H en lange kolommen L ⇒ groot plaatgetal N ⇒ Erg efficiënte scheidingen Nadeel: overloading treedt snel op ➢ door dunne vloeistoffilm van SF ➢ asymmetrische pieken

3

⇒ Beperkte en kleine staal hoeveelheden (geen preparatief werk)

Soorten capillaire kolommen 1) Wall-coated open tubular column (WCOT) Een dikke vloeistoffilm (0,1-5 µm) op de binnenwand vd kolom (= SF). Film wordt ontstaat door een vloeistof traag door de kolom te sturen → Cross-linking met binnenwand ➢ Hoog plaatgetal en snelle analyse 2) Support-coated open tubular column (SCOT) Vaste partikels gecoat met vloeistoffilm aan de binnenkant vd kolom. ➢ Mindere resolutie dan bij WCOT ➢ Groter contactoppervlak van de SF → meer staal opbrengen 3) Porous-layer open tubular column (PLOT) Vergelijkbaar met SCOT, maar partikels zelf zijn de SF, een vaste SF (adsorptiechromatografie) ➢ Laag plaatgetal en trage analyse

3. KEUZE VAN DE KOLOM Verschillende soorten kolommen beschikbaar dus rekening houden met verschillende parameters ➢ Soort kolom: Gepakt/capillair ➢ Afmetingen: Interne diameter, lengte, partikelgrootte ➢ Vloeistoffilm: dikte en type Soort kolom? Gepakte kolom: Voor preparatief werk Capillaire kolom: Voor analytisch werk ➢ Erg hoge plaatgetallen, N → efficiënte scheidingen Stationaire fase? Similia similibus solventur → polariteit ➢ Polaire analieten vertonen een hoge affiniteit voor een polaire SF en omgekeerd

4

➢ De MF is altijd apolair dus een apolaire SF zal weinig aantrekkingskracht uitvoeren op analieten ○ Scheiden is dan gebaseerd op kookpunten van analieten: analiet met het laagste kookpunt zal eerst elueren ➢ Polaire analieten kunnen interageren met polaire SF: dipool interacties & Hbruggen Bouw stationaire fase = Dunne, niet-volatiele vloeistoflaag op partikels die bestaat uit ➢ Polysiloxanen (a) ➢ Polyethyleenglycolen (Carbowax) (b)

→ Functionele groepen bepalen eigenschappen van de SF: ➢ Bepaalde polariteit ➢ Maximumtemperatuur: Boven deze temperatuur degradeert de kolom ○ Degradatie treedt sowieso op bij veroudering en werken met temperaturen rond de maximumtemperatuur = SF zal loskomen van de wand (= bleeding) ■ Verminderde performantie ■ interferentie bij detectie ■ Tailing van pieken door vrijkomende silanolgroepen ○ Best regelmatig kolom testen op veranderingen ○ Voorkomen door sterke chemische bindingen en cross-linking Ionische vloeistoffen als stationaire fase = Nieuwe technologie in capillaire GC kolommen waarbij opvallend weinig bleeding optreedt en zorgen voor nieuwe selectiviteiten en nieuwe affiniteiten met analieten ➢ Kunnen erg hoge temperaturen aan ➢ Enorm stabiel 4. KOOKPUNT VAN ANALIET De vluchtigheid/volatiliteit en het kookpunt van de analieten spelen een belangrijke rol in het elueren door de kolom (Bij apolaire MF & SF) Hoe vluchtiger het analiet & hoe lager het kookpunt, hoe sneller door de kolom (Want meer analiet zal in gasfase zijn) Temperatuur van de kolom is ook een belangrijke parameter: 5

➢ Wordt gecontroleerd met behulp van een oven om zo T te veranderen ifv de tijd = temperatuursprogrammatie ○ Start temperatuur = T onder kookpunt analieten ⇒ Condensatie vooraan kolom ○ T gradueel verhogen ⇒ Analieten elueren 1 voor 1 door de kolom Nadeel temperatuurgradiënt ➢ Meerdere analyses na elkaar: kolom moet opnieuw afgekoeld worden (kost tijd) ➢ Bepaalde analieten hebben een te hoog kookpunt en zo niet geschikt voor GC ○ Oplossing: bij staalvoorbereiding chemische groepen toevoegen die kookpunt verlagen = Derivatisatie 3. MOBIELE FASE De mobiele fase komt altijd voor in gasfase en is apolair. (polaire gassen zijn zeldzaam) → 3 inerte gassen mogelijk als mobiele fase: ➢ Helium ○ Uitputbaar & duur ○ Meest gebruikt ○ Meest compatibel met detectoren ➢ Stikstofgas, N2 ○ Minder efficiënte scheiding ○ Laag optimaal debiet → trage analyses ○ Afwijking vh optimale debiet heeft een negatieve invloed op plaathoogte H ➢ Waterstofgas, H2 ○ Niet veilig, explosief ○ Men kan erg hoge debieten gebruiken zonder invloed op plaathoogte → De keuze is afhankelijk van kostprijs, veiligheid, scheidings efficiëntie, interactie met detector → Altijd met zuivere draaggassen werken ➢ Onzuiverheden kunnen SF aantasten en interfereren met detectoe ➢ Eerst door purifiers sturen om onzuiverheden te verwijderen

6

Dalbreedte is een soort van buffer voor het debiet voordat de plaathoogte stijgt 4. INJECTOREN Complex mengsel van analieten in vloeibare vorm wordt geïnjecteerd in het GC systeem ➢ Mengsel het liefst in een vluchtig solvent (ethylacetaat, hexaan) ➢ Glazen injectiespuit in verschillende maten (0.5-500µm) ➢ Spuit spoelen met zuiver solvent om carry-over te voorkomen → DOEL: analieten in zo’n smal mogelijke band op kolom brengen Werking van injecteren ➢ Injectie door rubberen septum (sluit zich onder druk vh draaggas) ➢ Purge gasstroom onder het septum om contaminatie en bleeding van componenten uit het septum te voorkomen ➢ Verhitte injectiekamer ⇒ alle analieten in gasfase ➢ Glazen buis, de liner in injectiekamer maakt verbinding tussen injectie en kolom ⇒ snelle & uniforme verdamping Injectievolume: rekening houden met expansie naar gasfase 1. SPLIT/SPLITLESS INJECTIE De stationaire fase van de capillaire kolom heeft een dunne vloeistoffilm → beperkte injectiecapaciteit ➢ Veel te geconcentreerde mengsels worden geïnjecteerd ⇒ overloading Oplossing: Split injector = Er gaat maar een kleine fractie van de geïnjecteerde hoeveelheid naar de kolom, de rest gaat weg via de split vent

➢ Split Ratio = ratio tussen split flow en column flow = 50:1 - 600:1 ○ 50 moleculen worden geïnjecteerd → 1 gaat door de kolom ➢ Snelle injectie in split modus (hoge debieten), trage flow in de kolom ➢ Zeer hoge temperatuur in injectiekamer → alles enorm snel in gasfase brengen ➢ Kolom op temperatuur hoger dan kookpunt solvent, lager kookpunt analyse ⇒ Condensatie analieten Voordelen ➢ Snelle injectie en smalle band op kolom Nadelen ➢ Hoge temperaturen nodig, erg lage concentraties (soms wordt niets gedetecteerd) Splitless injectie = Hetzelfde principe als de split injector, enkel is de split vent nu gesloten ⇒ Alles wat geïnjecteerd wordt komt op de kolom ➢ Toegepast bij stalen met extreem lage concentraties ➢ Tragere injectie → bredere band op de kolom en lagere temperatuur in injectiekamer ○ Degradatie staal voorkomen ○ Brede band heeft een negatief effect op de scheiding ➢ Oplossing voor goede scheiding: Focusing = kolom heeft een begintemperatuur lager dan het kookpunt van solvens ○ Solvens zal condenseren aan begin vd kolom ○ Analieten worden zo in een smalle band gevangen → minimaliseert piekverbreding Nadelen: afkoeling duurt langer omdat we van een lagere T moeten vertrekken Pulsed splitless injectie = door druk uit te oefenen zal de injectietijd verkorten en kan de de temperatuur in de injectiekamer verhoogd worden → Smallere pieken Intermediaire splitless = Pas na een bepaalde tijd de split vent openzetten (15 sec) ➢ Werkt als opzuivering ➢ Zo komen bepaalde stoffen op de kolom en andere niet afhankelijk van vluchtigheid en temperatuur 2. ON-COLUMN INJECTIE → Voor analieten die gevoelig zijn voor degradatie bij temperaturen boven hun kookpunt ➢ oplossing met analieten wordt rechtstreeks op de kolom gebracht ➢ Geen injectiekamer, geen liner, geen hoge T ➢ Initiële kolomtemperatuur is van groot belang → volledig verantwoordelijk voor condensatie analieten Nadeel: Minder goede resolutie 3. PROGRAMMED TEMPERATURE VAPORISER → Techniek die voordelen van split, splitless en on column combineert ➢ Injectie gebeurt op lage temperatuur, nog in vloeibare vorm

8

➢ Temperatuur zal opgevoerd worden zodat de analieten in gasfase gebracht worden bij een zo laag mogelijke T → Onthouden dat het bestaat 5. DETECTOREN Na de scheiding moeten de analieten gedetecteerd worden, geïdentificeerd (vgl met standaarden) en gekwantificeerd (piekoppervlakte) met detectoren. Er zijn zowel algemene detectoren als specifieke. 1. THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR TDC = de eerst ontwikkelde detector, simpel maar niet echt gevoelig (preparatief werk) ➢ Kan gebruikt worden met helium & waterstofgas ➢ Algemeen en niet destructief → TDC techniek = detector die bestaat uit 2 filamenten in een verwarmingsblok ➢ MF die uit de GC kolom komt wordt door het verwarmd filament gestuurd ○ Temperatuur vh filament hangt af van warmtegeleiding vd MF ○ Wanneer er analieten uit de kolom komen verandert de warmtegeleiding van MF → Signaal ➢ Referentie filament & referentiegas met een vaste temperatuur ➢ Temperatuurverschil tussen beide filamenten → detector respons 2. FLAME IONIZATION DETECTOR FID = 100x gevoeliger dan TDC ➢ Bruikbaar voor de meeste organische verbindingen ➢ Destructief ➢ Compatibel met He, H2 en het beste met N2 → FID techniek = MF die uit de kolom komt wordt verbrand in mengsel van waterstofgas en perslucht ➢ Koolstofatomen ioniseren in de vlam ➢ Ionenvorming afhankelijk van aanwezige functionele groepen ○ Carbony & carboxyl ioniseren niet ➢ Ionisatie → Elektronen → Elektrische stroom → omgezet in signaal 3. FLAME PHOTOMETRIC DETECTOR FPN = meet de optische emissie van geëxciteerde P, S, Pb of Sn atomen (analieten die deze atomen bevatten) ➢ atomen worden geëmitteerd bij specifieke golflengte → licht → signaal ➢ Gevoelig, destructief

9

➢ Voor analyse van mercaptanen en pesticiden 4. NITROGEN PHOSPHORUS DETECTOR NPD = afgeleid van FID, specifiek voor N, P-houdende analieten ➢ Detector bestaat uit een keramische ring behandeld met alkalizouten ➢ De ring onderdrukt het normale FID signaal ➢ N&P houdende analieten geven wel elektrische stroom → signaal → Geschikt voor drugs, geneesmiddelen en pesticiden 5. ELECTRON CAPTURE DETECTOR ECD = specifieker dan TCD & FID & geschikt voor detectie van gehalogeneerde moleculen, geconjugeerde carbonylverbindingen, nitril- en nitroverbindingen en organometalen ➢ Gevoelig en selectief ➢ N2 of 5% methaan in argon als make up gas → ECD techniek = elektrode uit radioactief materiaal → straalt elektrodestroom ➢ MF gaat door elektrode stroom ➢ Wanneer analieten door de stroom gaat en deze verandert → signaal

6. MASSASPECTROMETRIE MS = Krachtige en complexe detectietechniek met kwantitatieve en kwalitatieve informatie ➢ Analieten uit de kolom worden geïoniseerd i ionisatiebron ○ Botsing van elektron & analiet → Geïoniseerd analiet A+ ➢ Massa van A+ wordt bepaald als Massa/lading verhouding ○ Lading is meestal gelijk aan 1 ➢ Geeft chromatografische pieken + massa’s van analieten 6. METHODEONTWIKKELING IN GC Verschillende doelen en keuzes maken bij een analyse Doelen: ➢ Wat scheiden? ➢ Kwantitatief of kwalitatief scheiden? ➢ Gevoeligheid nodig? Keuzes: Staalvoorbereiding, Kolom, Ovenparameters, Injectie & Detectie 1. STAALVOORBEREIDINGEN = Transformeren van een te analyseren staar naar een compatibele vorm met GC, het liefst een mengsel van analieten opgelost in vluchtig solvent Hoe? ➢ Extractie, aanconcentratie (indampen), verwijderen van interferenties, opzuivering indampen

10

= Indampen van vloeibaar staal onder stikstofgas om een concentratie van analieten te verkrijgen + staal in solvent brengen voor GC ➢ Liefst ethylacetaat ➢ Geen dichloromethaan → indampen en heroplossen Head-space = veel gebruikte en gemakkelijke techniek (techniek bij alcohol in bloed) ➢ Staal in flesje schudden op hoge temperatuur → Evenwicht tussen analieten in vloeibare en gasfase ➢ Gasfase wordt rechtstreeks geïnjecteerd Voordeel: alle analieten zijn in gasfase Solid-phase micro-extractie = goede techniek maar nog optimalisatie nodig ➢ In injectiespuit stukje fused silica met bepaalde SF = micro-fiber ➢ Fiber in de te analyseren oplossing brengen → analieten hechten zich op fiber (extractie) ➢ Injectie fiber in GC Nadeel: selectieve adsorptie, niet alle analieten worden uit de oplossing geextraheerd Stir-bar sorptive extraction = vergelijkbare, afgeleide techniek van SPME ➢ Gecoat magnetisch staafje met SF in oplossing met analieten brengen ➢ Magnetisch roeren → Componenten hechten zich aan SF ➢ Staaf in thermal desorption tube → analieten komen los van SF → naar GC kolom Verschil met SPME: dikkere laag SF kan gebruikt worden → meer extractie uit staal → gevoeligere analyse Nadeel: aankoop thermal desorption tube Thermische desorptie = Techniek om vluchtige analieten in vaste vorm te analyseren met GC ➢ Staal in glazen of stalen drager plaatsen ➢ Purgeren met draaggas om zuurstof te verwijderen ➢ Drager connecteren met GC kolom + hoge T Derivatisatie = analieten GC compatibel krijgen (lage vluchtigheid, hoge polariteit ≠ GC compatibel) door modificatie van analieten ➢ Chemische groepen inplanten → polariteit daalt, vluchtigheid stijgt, gevoeligere detectie ○ Trimethylsilylderivaten = groepen om op carbonzuren, alcoholen, amines te plaatsen ○ Methylderivaten = worden geplaatst via reactie met diazomethaan ○ Trifluoro Acyl Derivaten = CF3CO groep op alcoholen & amines plaatsen

11

Nadeel: Reproduceerbaarheid van analyses wordt beïnvloed (is de chemische reactie altijd hetzelfde)

2. KEUZE VAN DETECTOR Verschillende detectoren beschikbaar met voor en nadelen ➢ Algemene (FID, MS) of specifieke (NPD) detector ➢ Gevoeligheid nodig, TDC is minder gevoelig, ECD erg gevoelig ➢ MS geeft het meeste informatie en krachtige techniek → wel complexe interpretatie

3. KEUZE VAN DE KOLOM Gepakt of capillair? → Type stationaire fase? ➢ apolair, intermediair polair of polair ➢ Gas-solid of Gas-liquid → Interne diameter en Filmdikte ➢ Kleine ID en dunne filmdikte ⇒ betere resolutie, snelle analyse ➢ Grote ID en dikke filmdikte ⇒ meer injectie capaciteit → Lengte ➢ Lange kolom ⇒ Goede resolutie, lange analyses (grote injectie capaciteit) ➢ Korte kolom ⇒ hoge resolutie, snelle analyse 4. INJECTIEMETHODE EN KOLOMTEMPERATUUR → Type injector: Split, Splitless, on-column, PTV ➢ afhankelijk van het staal ➢ weerstand aan hoge T → Kolomtemperatuur ➢ afhankelijk van injectiemethode ➢ kookpunten van solventen en analieten

12...