Practica 1 - la elaboración de agares nutritivos para cultivo bacteriano PDF

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la elaboración de agares nutritivos para cultivo bacteriano ...

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SEC.D04 Práctica N°1 Ciclo:2020-A

Campos Loza José Antonio Vázquez Paulino Olga Deli Microbiología

Practica 1 Preparación de medios de cultivo Objetivo de aprendizaje ● ● ●

Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiología. Hacer un primer acercamiento a la manipulación de microorganismos. Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las técnicas más comunes para realizarlo.

Antecedentes. Las bacterias u otros microorganismos que se desarrollan en medios de laboratorio, se llaman cultivos. Las diferentes especies de bacterias que se desarrollan en la misma clase de medios de cultivo pueden tener aspectos muy diferentes, y por tanto, el conocimiento de las características de cultivo de las especies es útil para reconocer a ciertos tipos de bacterias. Las bacterias deben ser obtenidas en cultivo puro para determinar las características del cultivo o cualquier otra propiedad de las especies. Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita como requisito previo el cultivarlos en condiciones de laboratorio. Para lograr esto es preciso conocer cuáles son los nutrientes y las condiciones físicas que requieren. Mediante investigaciones extensas se han determinado las necesidades nutricionales de las bacterias, y esta información ha sido la causa del desarrollo de numerosos medios de cultivo. Ya que las necesidades nutricionales de las bacterias varían de manera muy amplia, existen diferencias muy importantes en cuanto a la composición de los medios empleados. Las bacterias también tienen diferencias notables en lo que respecta a las condiciones del ambiente que favorece su proliferación. Desde los hombres hasta los microorganismos tienen en común determinadas necesidades nutricionales en términos de necesidades químicas para llevar a cabo su crecimiento y sus funciones normales. 1. 2. 3. 4. 5.

Todo organismo vivo necesita una fuente de energía. Todo organismo vivo necesita obtener carbono de una manera. Todo organismo vivo necesita obtener nitrógeno de alguna manera. Todo organismo vivo necesita azufre y fosforo. Todos los organismos vivos necesitan de varios metales como Na, K Ca, Mg, Mn, Fe, Zn, Cu, P, Co, para que puedan crecer normalmente. 6. Todo organismo vivo tiene vitaminas y compuestos vitaminados. 7. Todos los organismos necesitan agua para su crecimiento.

Campos Loza José Antonio Vázquez Paulino Olga Deli Microbiología

SEC.D04 Práctica N°1 Ciclo:2020-A

Se necesita de un gran número de sustancias químicamente puras para cultivar bacterias que tengan necesidades nutricionales como los lactobacilos .Aunque para el cultivo de bacterias heterótrofas en laboratorios de rutina generalmente se basan en medios de cultivo sintéticos. Se usan ciertos materiales crudos como peptonas, extracto de carne y extracto de levadura y así el medio de cultivo que se obtiene hace posible el desarrollo de gran variedad de bacterias y otros microorganismos. Cuando se desea un medio solido se toma un agar como agente solidificante. A partir de estos ingredientes es posible preparar un medio capaz de permitir el crecimiento de muchas bacterias heterótrofas Tipos de medios Se necesitan muchos medios de cultivo elaborados para propósitos especiales que facilitan la identificación, aislamiento y cuantificación de ciertos tipos de bacterias. A los medios de cultivo se les puede clasificar de la siguiente manera: Medios Enriquecidos: la adición de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les proporciona sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los heterótrofos exigentes. Medios Selectivos: la adición de agar nutritivo de ciertas sustancias químicas específicas, no permitirá el desarrollo de un grupo de bacterias, sin inhibir al mismo tiempo el crecimiento de otros grupos. Medios Diferenciales: la adición de ciertos reactivos o sustancias químicas a los medios de cultivo trae como resultado determinado tipo de crecimiento bacteriano o de cambios, lo cual permite al observador diferenciar distintos tipos de bacterias. El medio agar-sangre sirve simultáneamente como medio de enriquecimiento y diferencial. Medios de Prueba: para el ensayo de vitaminas, aminoácidos y antibióticos, se utilizan medios de cultivo de composición conocida. Así mismo, se recurre a medios de composición especial para probar desinfectantes. Medios para Cuenta de Bacterias: para determinar el contenido bacteriano de sustancias tales como la leche y el agua. Se debe señalar su fórmula así como las especificaciones prescritas. Medios para Caracterizar Bacterias: para determinar el tipo de crecimiento producido por los organismos, así como la capacidad de las bacterias para producir cambios químicos. Medios de Mantenimiento: para preservar satisfactoriamente las características fisiológicas y la viabilidad de un cultivo. El crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Materiales Reactivos: ● ●

Agar para metodos estandar Agua destilada

Campos Loza José Antonio Vázquez Paulino Olga Deli Microbiología

SEC.D04 Práctica N°1 Ciclo:2020-A

Equipo: ● ● ● ● ● ● ●

Balanza granataria Vaso de precipitado Pipeta volumétrica de 100ml Agitador magnético Parrilla eléctrica Autoclave Cajas Petri

Materiales Auxiliares: ● ● ● ●

Papel estraza Algodón Aluminio Cinta testigo

Preparación de los medios. Para el cultivo de las bacterias se recurre a algunas sustancias naturales comunes. Los materiales, en su forma natural, no presentan ningún problema para tomarlos como medios de cultivo ya que simplemente se depositan dentro de los envases adecuados tales como tubos de ensayo, o matraces, los cuales deberán ser esterilizados antes de utilizarlos. Los medios que se preparan del tipo agar o caldo nutritivos, se hacen mezclando los ingredientes individuales necesarios. En la preparación de medios de cultivo, se deben seguir los siguientes pasos: 1. Cada ingrediente se debe disolver en un volumen adecuado de agua destilada. 2. Se determinará el pH del medio y si es necesario se ajustará. 3. El medio se pondrá en recipientes adecuados como tubos, matraces, botellas, cuyas bocas se cierran con tapones de algodón, plástico o cubiertas de metal. 4. Los medios se esterilizan generalmente en autoclave. Para obtener un buen desarrollo de las bacterias, el trabajador de laboratorio deberá: ● ●

Inocular las bacterias en un medio de cultivo que tenga los nutrientes necesarios. Incubar el medio ya sembrado en condiciones físicas apropiadas.

Desarrollo 1. 2. 3. 4.

Lavar y desinfectar la mesa de trabajo. Lavar, escurrir y acondicionar el material a usar. Hacer un pequeño plato con papel aluminio para pesar, según las instrucciones. Anotar los datos de la etiqueta del frasco del medio de cultivo a preparar:

Agar de métodos Estándar. Medio de Cultivo BIOXON. ● ●

Nombre del medio: Agar Metodo Estándar Tipo de medio (para que tipo de microorganismos se recomienda): Recuento con placa de bacterias en microbiología sanitaria.

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Método de preparación: agar en placa Ingredientes: peptona de capseína, extracto de levadura, dextrosa, agar Condiciones de esterilización: esterilización a vapor de 115 – 120°C

Método de preparación para Agar Fenilalanina Nombre del medio: Agar Fenilalanina. Tipo de medio (para que tipo de microorganismos se recomienda): Recuento con tubo de bacterias en microbiología sanitaria. ● Método de preparación: agar en tubo ● Ingredientes: DL-Fenilalanina, extracto de levadura, cloruro de sodio,fosfato disódico, agar ● Condiciones de esterilización: esterilización a vapor de 115 – 121°C 5. Realizar los cálculos de acuerdo al medio de cultivo a preparar así como a la cantidad a preparar. Considerar la capacidad de los materiales a usar. ● ●

Cálculos para agar Estándar

Cálculos para agar Fenilalanina

Método de Preparación para Agar de métodos Estándar. Medio de Cultivo BIOXON. ➢ Suspender 2.444g del polvo en un 104 ml de agua purificada. ➢ Mezclar perfectamente con el agua. ➢ Calentar con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta disolución completa. ➢ Medir el pH 7.00 +- 0.2 ➢ Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 16 minutos. ➢ Distribuir en Cajas Petri con cerca de 20 ml de agar en cada caja. ➢ Dejar que el medio solidifique por un tiempo (20 min. Aprox.). ➢ Después sellar los bordes de la caja con cinta para que no se abra por algún descuido. ➢ Guardar en refrigerador.

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➢ Colocar en la estufa de cultivo, una placa testigo, y una placa (invertida) por alumno, a 37°C por 12 horas. ➢ Al siguiente día checar si hubo crecimiento. Se debe esperar que las placas no presenten crecimiento, es decir que no presenten cambios de color, olor y aspecto, esto denotará un crecimiento negativo ➢ Si los resultados fueron negativos, colocar invertidas las placas por equipo dentro de una bolsa de plástico y guardarlas en el refrigerador colocando en la etiqueta; # de equipo, nombre del medio de cultivo, y fecha de preparación. Método de Preparación para Agar Fenilalanina. ➢ Rehidratar 2.392g del medio en 104ml de agua destilada. ➢ Reposar 10 a 14 minutos. ➢ Calentar hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolver por completo. ➢ Distribuir en tubos de 13x100mm, tapar y llevar a autoclave a esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. ➢ Dejar enfriar en posición inclinada. ➢ Al siguiente día checar si hubo crecimiento. Se debe esperar que que no presenten crecimiento, es decir que no presenten cambios de color, olor y aspecto, esto denotará un crecimiento negativo ➢ Si los resultados fueron negativos, colocar por equipo en una gradilla y guardarlas en el refrigerador colocando en la etiqueta; # de equipo, nombre del medio de cultivo, y fecha de preparación. Conclusiones: La práctica abarco algunas sesiones de clase, Nos costó un poco de trabajo realizarla y tuvimos algunos contratiempos e incidentes pero pues aprendí a preparar el medio de cultivo en placa y tubo que parecía sencillo pero no fue tan fácil, al final revisamos nuestros medios y algunos salieron contaminados, como por ejemplo el mío y ahí fue cuando me di cuenta de que no hice la practica correctamente pero iremos perfeccionando nuestra técnica con el paso del tiempo ya que será un trabajo rutinario. También algo muy importante es que para preparar los medios de cultivo se necesita de mucha limpieza, ya que de lo contrario todo saldrá mal. Bibliografía consultada: ❖ Tortora, G., Berdell, F. & Case, C. (2017). Introducción a la Microbiología. 12va Edición. Cuidad Autónoma de Buenos Aires. Editorial; Médica Panamericana. ❖ https://www.franrzmn.com/fenilalanina-desaminasa-fad/ ❖ https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2824e447e10.pdf ❖ https://www.lifeder.com/agar-cuenta-estandar/ Anexos:

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Reporte de esterilidad y promoción de desarrollo en medio de cultivo estándar

Cultivo estándar con bacillus

Cultivo estándar estéril...