Práctica 5. Cinética de la enzima ureasa. PDF

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Universidad Nacional Autónoma de MéxicoFacultad de Estudios Superiores CuautitlánCampo 4Medicina Veterinaria y ZootecniaBioquímica.PRÁCTICA 5. Cinética de la enzima ureasa.Profesores:MVZ Silvia Leticia Bonilla OrozcoMVZ Juana Alicia Alquicira CamachoMVZ Francisco Javier Cervantes AguilarEquipo: 5Góm...

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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 4 Medicina Veterinaria y Zootecnia Bioquímica.

PRÁCTICA 5. Cinética de la enzima ureasa. Profesores: MVZ Silvia Leticia Bonilla Orozco MVZ Juana Alicia Alquicira Camacho MVZ Francisco Javier Cervantes Aguilar Equipo: 5 Gómez González Aylín Daniela Hernandez Buatista Jesus Eduardo Grupo: 1101

1. RESUMEN Para la elaboración de la práctica se prepararon una serie de tubos de ensaye con las siguientes sustancias: Tubos de la serie 1: se preparó con urea 0.25, amortiguador de fosfatos pH 7.2, agua destilada, ureasa y con bicloruro de mercurio 1%. Para medir utilizamos las pipetas con ayuda de la propipeta (de la misma manera medimos los demás tubos restantes). Tubos de la serie 2: para su elaboración se utilizó urea 0.25, amortiguador de fosfatos pH 7.2, ureasa y bicloruro de mercurio 1%. Tubos de la serie 3: se utilizó urea 0.25 M, amortiguador de fosfatos pH 7.2, ureasa y bicloruro de mercurio 1%. Tubos de la serie 4: para el último tubo se necesito urea 0.25 M, 4,5 mL de fosfatos con pH, ureasa y bicloruro de mercurio 1%. Los tubos se sometieron dos veces a baño maría a 50 °C durante 5 min. y 30 min. Después de su preparación se titularon 5 ml las muestras para lo cual nos apoyamos con el indicador rojo de metilo, para así obtener una tonalidad amarilla. Cuando la solución fue amarilla se agregó ácido clorhídrico 0.1 N hasta que la coloración cambió a un canela. Este proceso se repitió con cada uno de los tubos de ensayo preparados.

2. INTRODUCCIÓN 2.1 ENZIMAS La autora Alquicira J. A. (2020) en el material didáctico “ENZIMAS”, presenta las siguientes generalidades respecto a las enzimas, estructura, características y clasificación. Las enzimas son biocatalizadores, es decir, compuestos de origen biológico que aceleran las reacciones químicas. Tienen la capacidad de acelerar las reacciones químicas sin alterarse al final de éstas y sin modificar el equilibrio químico sólo acortan el tiempo de reacción. 2.1.1 CARACTERÍSTICAS · ·

Son los catalizadores más eficientes que se conocen. 

Presentan especificidad: es la capacidad de actuar sobre un solo sustrato (especificidad absoluta) o sobre 2 o más sustratos son químicamente parecidos (especificidad relativa) 

·

Su actividad está sujeta a regulación por MODULADORES que la activan (modulador positivo) o disminuyen su actividad (modulador negativo)

·

Casi todas las enzimas son proteínas, pero también hay ácidos nucleicos catalíticamente activos llamados “ribozimas”

·

Entre las miles de sustancias presentes en una célula, las enzimas constituyen la parte más importante de las proteínas celulares

·

Todas las reacciones bioquímicas son catalizadas por enzimas. Se conocen unas 2000



2.1.2 ESTRUCTURA HOLOENZIMA: es la enzima completa y activa. Es la unión de la apoenzima más el cofactor APOENZIMA: es la parte proteica de la enzima COFACTOR: son moléculas pequeñas de origen orgánico o inorgánico (no proteico) requeridos para la actividad de la enzima

2.1.3 CLASIFICACIÓN:

El autor Orozco. E (2016) en su artículo: Aspectos estructurales y mecanísticos de la enzima ureasa y sus proteínas accesorias, postula lo siguiente con respecto a la enzima ureasa UREASA La ureasa (EC 3.5.1.5) es una enzima cristalizada, y funcionalmente pertenece a las familias amidohidrolasas y fosfotriesterasas (Todd et al., 2006) que cataliza la hidrolisis de urea a amonio y carbamato, este último se hidroliza espontáneamente y genera bicarbonato y un segundo ion amonio.

3. MARCO TEÓRICO 3.1 CINÉTICA ENZIMÁTICA Gracias a la bibliografía consultada en clase, brindada por Alquicira J. A. (2020), se aprecian las siguientes particularidades respecto a la cinética enzimática: Estudia la velocidad de las reacciones bioquímicas Su estudio se basa en la velocidad de cambio que tiene lugar en la concentración de reactivos o de productos por unidad de tiempo Los factores principales que afectan la actividad enzimática son: concentración de enzima, de sustrato, pH, temperatura e inhibidores.

Relación de la velocidad con la concentración de enzima la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de substrato.

3.2 INHIBICIÓN Del mismo modo, inhibidores:

la autora Alquicira J. A. (2020) señala que la inhibición o

Es cualquier agente químico capaz de disminuir la velocidad de una reacción sin desnaturalizar la enzima. Son compuestos que tienen la capacidad de unirse a la enzima de tal forma que impiden la combinación E-S. Existen 2 tipos de inhibición: I. IRREVERSIBLE: El inhibidor se une covalentemente y modifica 1 o más grupos funcionales esenciales para la catálisis provocando la inactivación total de la enzima, la cual no tiene posibilidad de regenerarse se considera como un envenenamiento enzimático.

I. REVERSIBLE: Existen diferentes tipos de inhibidores competitivos, no competitivos y acompetitivos.

Inhibición Competitiva · El inhibidor compite con el sustrato por la unión con el centro activo de la enzima, impidiendo la catálisis. · El inhibidor tiene por lo general una similitud estructural con el sustrato, pero no experimenta la reacción catalítica · La enzima (E) se combina reversiblemente con el inhibidor (I) dando un complejo EI · Concentraciones  crecientes de (S) desplazan al (I)

Inhibición No Competitiva

· · ·

 l inhibidor no se une al sitio activo de la enzima, sino a algún grupo químico E situado en un lugar distinto La fijación del inhibidor no bloquea la fijación del S y viceversa El incremento de la concentración del S no reduce el efecto inhibidor por lo que es irreversible

Inhibición Acompetitiva ·

Se presenta generalmente en reacciones enzimáticas con 2 más sustratos

·

 l inhibidor acompetitivo se fija en un lugar distinto al sustrato, pero E requiere que la enzima este unida previamente al sustrato en forma de ES

·

La reacción se ve retrasada pero no impedida, el sitio activo no se ve afectado

4. OBJETIVOS

● Determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas y la manera en la que pueden ser observados y medidos en el laboratorio, tomando como ejemplo a la ureasa producida por el frijol de soya. ● Determinará la influencia del inhibidor Bicloruro de Mercurio (HgCl2), en la reacción catalizada por la ureasa.

5. MATERIALES Material y equipo ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●

5 Tubos de ensaye grandes 3 Pipetas (1, 5 y 10 mL) 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL 1 Bureta de 25 o 50 mL 1 Soporte universal 1 Pinzas de bureta 1 Propipeta Gradilla para tubos de ensaye Agitador Vórtex 1 Piseta Termómetro Baño María

Reactivos y soluciones ● ● ● ● ● ●

Urea 0.25 M. Amortiguador de fosfatos 0.05 M, pH 7.2. Amortiguador de fosfatos de pH diferentes Bicloruro de mercurio al 1%. Ácido clorhídrico 0.1 N. Rojo de metilo al 0.04%.

Muestra biológica ● Extracto de ureasa proveniente de frijol de soya Material que deberá traer cada equipo ● ● ● ●

Guantes de látex Toallas de papel Plumón indeleble Detergente

6. METODOLOGÍA 1.- Se prepararon la siguiente serie de tubos: Serie 1 de tubos con variación en la concentración de sustrato (urea).

● Tubo 1: 01.5 mL de Urea 0.25M, 1 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 y 8 mL de agua destilada. ● Tubo 2: 1 mL de Urea 0.25M, 1 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 y 7.5 mL de agua destilada. ● Tubo 3: 2 mL de Urea 0.25M, 1 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 y 6.5 mL de agua destilada. ● Tubo 4: 5 mL de Urea 0.25M, 1 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 y 3.5 mL de agua destilada. ● Tubo 5: 7.5 mL de Urea 0.25M, 1 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 y 1 mL de agua destilada. Serie 2 de tubos con variación en la concentración de enzima (ureasa). ● ● ● ● ●

Tubo 1: 7.5 mL de Urea 0.25M, 3.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 2: 7.5 mL de Urea 0.25M, 3.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 3: 7.5 mL de Urea 0.25M, 3.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 4: 7.5 mL de Urea 0.25M, 3.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 5: 7.5 mL de Urea 0.25M, 3.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2

Serie 3 de tubos con variación de la temperatura ● ● ● ●

Tubo 1: 7.5 mL de Urea 0.25M, 2 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 2: 7.5 mL de Urea 0.25M, 2 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 3: 7.5 mL de Urea 0.25M, 2 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 4: 7.5 mL de Urea 0.25M, 2 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2

Serie 4 de tubos con variación en el pH del medio. ● ● ● ● ●

Tubo 1: 5 mL de Urea 0.25M, 4.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 4.5 Tubo 2: 5 mL de Urea 0.25M, 4.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 6.0 Tubo 3: 5 mL de Urea 0.25M, 4.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 7.2 Tubo 4: 5 mL de Urea 0.25M, 4.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 8.5 Tubo 5: 5 mL de Urea 0.25M, 4.5 mL de Amortiguador fosfatos pH 10

2.- Las series de tubos 1, 2 y 4 se incubaron en baño María durante cinco minutos a 50°C. La serie de tubos número 3 se incubaron a 0°C (refrigerador), 20°C (temperatura ambiente), 50°C y 80°C respectivamente. 3.- Después de la incubación a las series de tubos 1, 3 y 4 se le agregaron a cada tubo 0.5 mL de Ureasa. A los tubos de la serie número 2 se le agregaron 0.1 mL, 0.3 mL, 0.5 mL, 0.7 mL y 0.9 mL respectivamente. Los tubos se agitaron con el agitador Vórtex antes de realizar la segunda incubación. 4.- Las series de tubos 1, 2 y 4 se volvieron a incubar a baño María a 50°C pero esta vez durante 30 minutos. Los tubos de la serie número 3 se incubaron a 0°C, 20°C, 50°C y 80°C respectivamente durante 30 minutos. 5.- Después de la segunda incubación se le agregaron a cada tubo de las series 1, 2, 3 y 4, 4 gotas de HgCl2 al 1% para detener la reacción.

Cuando la reacción con el HgCl2 al 1% se llevó a cabo verificamos que se haya creado un nuevo producto utilizando un indicador. 6.- Para la titulación agregamos 2 gotas del indicador rojo de metilo a cada uno de los tubos de las cuatro series. 7.- Si la solución obtuvo un color amarillo es porque se obtuvo producto final (NH4OH) y se procedió a titutar, en cambio, si la solución obtuvo un color rosa es porque no se obtuvo un producto y en este caso no se tituló. 8.- Cada una de las soluciones con coloración amarilla fueron tituladas agregándoles lentamente con una bureta ácido clorhídrico 0.1 N hasta que el color del indicador se volvió de una tonalidad canela. 7. RESULTADOS Determinación del efecto de la variación en la concentración de sustrato (urea) sobre la velocidad de reacción de la ureasa.

mM de urea hidrolizada= (mL gastados)(50) Urea hidrolizada (Y)

Concentración de sustrato (urea inicial) (X)

Determinación del efecto de la variación de en la concentración de enzima (ureasa) sobre la velocidad de reacción de la misma.

mM de urea hidrolizada= (mL gastados)(50)

Urea hidrolizada (Y)

Cantidad de mL de enzima (ureasa) (X) Determinación del efecto de la variación de la temperatura sobre la velocidad de reacción de la ureasa.

mM de urea hidrolizada= (mL gastados)(50) Urea hidrolizada (Y)

Variación de la temperatura (X)

Determinación del efecto de la variación del pH del medio sobre la velocidad de reacción de la ureasa.

mM de urea hidrolizada= (mL gastados)(50) Urea hidrolizada (Y)

Variación del pH (X)

8. CONCLUSIONES Tomando en cuenta los resultados obtenidos y las fuentes informadas, se llegaron a las siguientes conclusiones: Como se presentó en la práctica, se inicia el estudio de la cinética enzimática y la actividad de la misma sometida a los factores principales que la afectan tales como concentración de enzima de sustrato, pH, temperatura e inhibidores. Tal y como fue presentado por Alquicira J, A (2020). A continuación se comenzarán a retomar los gráficos presentes en Marco teórico y Resultados, con sus variables dependientes (Y) e independientes (X) Concentración de enzima Variable independiente (x) Cantidad de mL de enzima Variable dependiente (Y) Urea hidrolizada La relación de velocidad y actividad enzimática de la reacción, es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato Alquicira J, A (2020) Esto comprendido de una forma más “burda”, se interpretó a la manera de que cuando hay enzima de más o de menos, afecta el gráfico esperado. Mientras haya suficiente enzima y zonas activas, existiría una mayoría de altas en resultados. En nuestro experimento existió la diferencia en variables (Y) por las grandes o pequeñas cantidad de concentración que administramos. Aunque los productos obtengan reacción, no se tuvo una reacción en aumento uniforme. Posiblemente no fue la cantidad de enzima necesaria por reacción o áreas activas por reacción. Concentración de sustrato Variable independiente (x) Cantidad de de sustrato Variable dependiente (Y) Urea hidrolizada De acuerdo a características que presenta este otro factor que altera la cinética y actividad de la ureasa, asumiendo la presencia del sustrato, la reacción debió producirse en una sola dirección y ser estimado como su velocidad máxima (Vmáx) de reacción como la concentración de sustrato necesaria para alcanzar la semi-velocidad máxima (km). Aunque estos valores son constantes por la enzima, variaron independientemente uno del otro bajo condiciones de cantidad de sustratos diferentes a los esperados.

La tendencia diferencial en gráfica inicial y de resultados, está dada por la primera explicación conocida como saturación de enzima en meseta por el sustrato suministrado. La segunda explicación que también afecta, puede ser presentada como errores metodológicos; tales como malas incubaciones, malas condiciones para la persistencia de componentes de enzima, etc. Esta aunque no puede ser comprobada por nosotros, podría ser verificada por los laboratoristas al momento de un chequeo de condiciones bajo las que estuvo la práctica experimental.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS De acuerdo a los objetivos establecidos de la práctica y lo recabado de los resultados arrojados, podemos reconocer los siguientes aspectos: ● Conforme en determinar los diversos factores que influyen en la actividad de las enzimas, pudimos observar como cada uno de los tubos fue sometido a una temperatura, un cambio de pH y un aumento de sustrato, observando así una mayor o menor eficiencia enzimática al cambiar algunos de estos factores. ● Así mismo pudimos conocer la manera en la que esta reacción pudo ser observada gracias al rojo de metilo y calculada para así poder obtener el gráfico correspondiente. Así mismo pudimos ver la curvatura de cada una de estas reacciones, para determinar su eficiencia siendo sometida a ciertos cambios. ● Se determinó que el bicloruro de mercurio nos ayudó a que la reacción no ocurriera de manera inmediata, sino que la retrazo para así poder observar y obtener los datos de cada una de las muestras sometidas. ● Al final pudimos obtener las gráficas correspondientes pero con algunos valores inesperados. Esto debido a otros factores que no se tomaron en cuenta durante la práctica.

9. BIBLIOGRAFÍA

QFB. Alquicira J. A. (2020)“ENZIMAS”. Material teórico, diapositivas.

Orozco. E (2016) Aspectos estructurales y mecanísticos de la enzima ureasa y sus proteínas accesorias. ResearchGate. https://www.researchgate.net/publication/316793402_Aspectos_estructurales_ y_mecanisticos_de_la_enzima_ureasa_y_sus_proteinas_accesorias...