Resumen Pirosecuenciación PDF

Preview

Summary

Download Resumen Pirosecuenciación PDF

Description

P  irosecuenciación 454 O Roche INTRODUCCIÓN La Pirosecuenciación o Roche 454 és un tipo de secuenciación de nueva generación o next-generation, ya que se basa en la aplicación de tecnologías de secuenciación modernas. Además, es un tipo de secuenciación por síntesis. Esto significa que este proceso usa la síntesis de DNA mediante la DNA polimerasa para identificar las bases presentes en una secuencia de DNA. Además, está monitorizada a tiempo real o en todo momento. En resumen, esta técnica se basa en la incorporación de un dNTP por parte de la DNA polimerasa, de manera que se libera un PPi. Este inicia una serie de reacciones posteriores (con la acción de varias enzimas) que finalmente producen luz. La cantidad de luz producida es proporcional al número de nucleótidos incorporados. De esta forma podremos determinar la secuencia de nucleótidos de una cadena de DNA.

PROTOCOLO Los pasos principales de la pirosecuenciación 454 serían: primero, realizar una preparación de las muestras de DNA, a continuación amplificarlo mediante una PCR, procesar estos productos obtenidos y finalmente, se producen el conjunto de las reacciones características de la pirosecuenciación en el pirosecuenciador. 1) PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: Para preparar las muestras: ➔ Primero de todo, se aísla el DNA que queremos secuenciar del organismo o de la fuente correspondiente. ➔ A continuación, se fragmenta el DNA (por ejemplo, por hipersonicación, nebulización o mediante enzimas de restricción). ➔ Después, estos fragmentos de DNA obtenidos son ligados a adaptadores de oligonucleótidos, los cuales nos permitirán hibridar el primer. ➔ Finalmente, en caso de tener DNA de doble cadena, este se separa en cadenas sencillas.

2) PCR: ➔ Un primer reverso hibrida con la cadena de DNA a secuenciar concretamente con los adaptadores de oligonucleótidos que se han ligado en la preparación de las muestras. Este primer debe estar biotinilado en su extremo 5', es decir unido a biotina. ➔ Cada fragmento se une a un único bead de agarosa. Se produce una unión no covalente entre la streptavidina presente en los beads supermagnéticos y la biotina del extremo 5’ del fragmento de DNA. ➔ Se mezclan los beads con una emulsión de agua-aceite (esta emulsión está formada por unas micelas acuosas que contienen reactivos de PCR rodeados por aceite). Se produce una amplificación por PCR dentro de cada gotita, dando muchas copias de una plantilla única de ADN. ➔ La amplificación por PCR se realiza en un termociclador. ➔ Como he dicho anteriormente, en esta técnica se realiza una PCR en emulsión por puentes, la cual es muy utilizada para mantener los productos de PCR anclados a una matriz. ➔ Los beads resultantes están unidos con aproximadamente 1 millón de copias del fragmento de una sola cadena original, que proporciona una potencia de señal suficiente durante la reacción de pirosecuenciación que sirve para detectar y registrar los eventos de incorporación de nucleótidos.

3) PROCESAMIENTO PRODUCTOS PCR: ➔ Una vez hemos amplificado el DNA, se rompe la emulsión. De manera que el DNA se desnaturaliza con agentes desnaturalizantes, dejando inmóvil en los beads la cadena de DNA biotinilada, mientras que la otra cadena es lavada. La cadena enganchada al bead se convierte en la cadena molde y es la que sufre posteriormente, la reacción de pirosecuenciación. ➔ Este conjunto de los beads-DNA se deposita en los pocillos (mediante aplicación de un campo magnético) de una placa de picotitulación o PTP, que es una estructura capilar de sílice fundida. Los pocillos proporcionan una ubicación fija en la que se puede monitorizar cada reacción de secuenciación. 4) PIROSECUENCIACIÓN

Cada uno de los beads tiene ancladas a su superficie miles de copias de un solo fragmento de DNA, ya que proceden de una sola micela de la PCR en emulsión y, por lo tanto, constituían un único microreactor. La placa de picotitulación se sitúa en el pirosecuenciador, de manera que éste se encargará de monitorizar lo ocurrido en cada uno de los pocillos en todo momento, que será la síntesis de la cadena complementaria a las hebras de DNA que se encuentran unidas a los beads. Por otro lado, permitirá el suministro de nucleótidos a cada tempo y en el orden adecuado. Además de los dNTPs, para la reacción será necesario que se añadan en cada pocillo cuatro enzimas: la DNA polimerasa, la sulfurilasa, la luciferasa y la apirasa. También añadiremos ciertos sustratos: la luciferina y APS. La reacción de se va a desencadenar de la siguiente forma: → Partimos de DNA monocatenario biotinilado, el cual se corresponde con el originado por el primer reverso (ya que la otra cadena se ha lavado con anterioridad) de manera que obtendremos la secuencia directa. → Los dNTPs serán añadidos uno a uno en todos los pocillos por igual (es decir, se dispensará el mismo nucleótido para todos en cada momento). Se usan los nucleótidos normales a excepción del dATP, que se usa en su forma modificada dATPalphaS (contiene un azufre en el fosfato alpha) ya que su forma normal podría interferir en la reacción siendo sustrato de otras enzimas (luciferasa). Si el nucleótido añadido al pocillo no complementa con nuestra cadena molde, no se elongará la cadena complementaria y la apirasa se encargará de degradarlo para que no entorpezca el registro de datos. En el caso de que el nucleótido se añada con éxito (la polimerasa lo añade al extremo 3’-OH libre) se liberará un pirofosfato procedente de este nuevo nucleótido. → El PPi (pirofosfato) liberado, junto con el APS (un derivado del AMP), será sustrato de la sulfurilasa, que generará ATP. → El ATP activa la luciferasa, provocando la oxidación de la luciferina y dando lugar a oxiluciferina (entre otros productos) y luz. → La luz será registrada por una cámara óptica del pirosecuenciador y un software específico generará un pico en un gráfico que se llama pirograma.

ANÁLISIS DE RESULTADOS Como hemos visto anteriormente, cuando un nucleótido se une a la cadena naciente de DNA, se libera un pirofosfato, que será transformado en energía en forma de luz por la cadena de reacciones enzimáticas detalladas anteriormente por mis compañeras.

Esta luz, será detectada por un dispositivo de carga acoplada CCD que encontramos en el pirosecuenciador, que nos generará un pirograma donde se nos muestra los nucleótidos añadidos en la secuenciación. Este gráfico, en el eje de ordenadas encontramos la intensidad de luz captada por el detector, y en el eje de abscisas el orden de dispensación de nucleótidos ordenados en el tiempo. Por cada nucleótido elongado, se nos generará un pico en el gráfico, y aquellos nucleótidos que no se elonguen no presentarán una banda asociada. La intensidad de las bandas será proporcional al número de nucleótidos idénticos añadidos. Es decir, si dispensamos G, en este caso nos aparece un pico que nos indica que se han añadido 2G, que es el doble de intenso que si solo se hubiese añadido una guanina. Cabe destacar también, que tanto G, C o T generan una banda igual de intensa, a excepción de la A. Los nucleótidos de A que introducimos no son los dATP convencionales, ya que este es utilizado como sustrato de la luciferasa. De este modo introducimos un derivado como el dATP-α-S, que contiene un átomo de S unido en el grupo fosfato alpha, y cuya hidrolisis genera una intensidad lumínica un poco superior al resto. El orden de dispensación de los nucleótidos en el pocillo es importante a la hora de secuenciar. - Dispensación optimizada: la utilizaremos para obtener una serie de secuencias a partir de una secuencia prevista, es decir, sabemos la secuencia del fragmento que queremos analizar. De esta manera dispensaremos una secuencia que se asemeje a la prevista. -

Dispensación cíclica: la utilizaremos para secuenciar segmentos génicos desconocidos. Se basa en una adición de repeticiones en tándem de la secuencia AGCT. Este orden de dispensación es importante, y lo podemos ver en el ejemplo del oncogén KRAS. Aquí secuenciamos los codones 12, 13 y 14. Es posible que se dé la aparición de un SNP en el segundo nucleótido del codón número 12 y por tanto, desarrollar episodios cancerosos. En este caso, si realizamos una dispensación cíclica para secuenciar, obtenemos el siguiente pirograma (diapositiva 13). Cabe destacar que tenemos muestras de genoma mutado y genoma sin mutar, ya que procede de un extracto de tumor, y en este caso tenemos muchas más secuencias originales que mutadas. El primer nucleótido que dispensamos es la A, que no se une a la cadena. En cambio, el segundo nucleótido es la G, que sí que se elongará y percibimos su señal, que pertenece a 3 guaninas, dos de la cadena salvaje y una de la cadena mutada.

El siguiente nucleótido es una timina, que se unirá en la tercera posición de la cadena salvaje, mientras que la cadena de muestras mutadas no se elongará (todavía vamos por el primer nucleótido). La A ya sí que se elongará en la cadena mutada (su pico es tan pequeño porque el porcentaje de mutantes es inferior al de muestras de cadena salvaje). El siguiente en unirse es la G, que se une en la posición 4 y 5 de la cadena salvaje. Vemos que se ha producido un desplazamiento en la fase de lectura, debido a la aparición de un SNP. A partir del SNP, la cadena salvaje va por delante de la cadena mutada (salvaje à posición 5; mutada à posición 2), y esto genera dificultades a la hora de interpretar el pirograma. En estos casos, que disponemos de una secuencia previsible, es mucho mejor realizar una dispensación optimizada, ya que como podemos comprobar, se genera un pirograma mucho más sencillo de interpretar. Después de introducir las G, añadimos A, ya que prevemos que puede darse el SNP, de modo que se corrige este desplazamiento y las cadenas se van elongando a la par.

APLICACIONES ·En cuanto a las aplicaciones, la pirosecuenciación se puede utilizar para el análisis y la detección de oncogenes. ·Es importante también en el análisis de microbiomas, donde a partir de la secuenciación del gen que codifica para el rRNA 16S ribosomal, podemos determinar los distintos filos, clases, ordenes, familias y géneros de bacterias presentes en nuestra microbiota. Aquí podemos ver un ejemplo (diapo 15), donde a partir de muestras pertenecientes 3 sujetos distintos, podemos determinar los diferentes filos de microrganismos que contienen en su microbioma oral. · Destacar también su papel en el desarrollo de fármacos antibióticos. · Importante en estudios de metilación del DNA, como por ejemplo, el análisis de metilación de las islas CpG (explicado en la siguiente presentación). Esto se realiza tratando el DNA con bisulfito de sodio, que transforma citosinas en uracilos, en cambio, aquellas que se metilen no podrán convertirse. Realizando el proceso de amplificación y de secuenciación, en el lugar donde había C sin metilar, encontraremos T en nuestra secuencación, mientras que en las mC (citosinas metiladas), encontraremos señales de C. De esta manera podremos observar el porcentaje de metilación.

PREGUNTAS: Por qué se denomina PCR en emulsión? Porque cuando se une el DNA al bead, y esto se mezcla en una emulsión de agua/aceite. En esta emulsión hay unas micelas donde hay un mix de reactivos de PCR, y en cada una de ellas se produce la amplificación. De manera que en la micela se encuentra el DNA unido al bead, y es donde se produce la amplificación de este fragmento y se obtiene muchas copias de DNA en el mismo bead.

¿Por qué se retrasa una cadena de la otra en el análisis de resultados?

Debido a la presencia de un SNP, se generan dos tipos de secuencias muestra, la salvaje, y la mutada. Si realizamos una dispensación optimizada, no encontraremos este problema de lectura, pero en cambio siguiendo una dispensación de nucleótidos cíclica, si que lo encontramos. Cuando añadimos la G, se elongan las dos primeras posiciones de la cadena wild, y en la cadena mutante, la primera posición, ya que hay un SNP en la segunda posición. En la siguiente dispensación, se elonga la T de la tercera posición, mientras que la cadena mutante sigue por la primera posición. Aquí es donde vemos el retraso de la cadena mutante con respecto a la salvaje, la wild va por la posición 3, y la mutante por la 1. Este desplazamiento se arrastrará a lo largo del pirograma. ¿De dónde viene el pirofosfato? Cuando se une el dNTP a la cadena de DNA naciente (que se está sintetizando) se foma un enlace entre el extremo 3’-OH libre de esta y el P  -α  (fosfato alfa). De esta forma, se libera el PPi proveniente del dNTP añadido (el que se ha unido de novo).

Cuántas moléculas de DNA se ponen en un pocillo en la placa de picotitulación? Tan solo contienen un tipo de molécula de DNA por pocillo (un único bead-DNA), aunque en el bead hay miles de copias del mismo fragmento de DNA, ya que lo hemos amplificado anteriormente mediante la PCR en emulsión.

¿Por qué no usamos PCR convencional? Precisamente queremos aislar los distintos fragmentos de DNA de manera que se pueda monitorizar la reacción de cada uno de ellos por separado. Esto nos lo permite la PCR en emulsión, ya que en cada micela ya se aísla un único fragmento del cual se sintetizarán clones. En el momento de la pirosecuenciación obtendrás los datos correspondientes a una única secuencia. En una PCR convencional, todos los fragmentos estarían en el mismo medio sin distinción alguna. En la pirosecuenciación se obtendrían muchas secuencias superpuestas (cada fragmento generaría picos distintos al mismo tiempo) imposibles de identificar.

¿Se sabe por qué el dATP α da más señal en el pirograma? No se sabe a qué es debido el aumento en la señal del dATP- α ,  aunque se cree que es por una diferencia en la energía de Gibbs del PPi que se libera cuando este nucleótido modificado se une a la cadena de DNA naciente.

¿Por qué se utiliza el dATP α ? Porque el ATP actúa en las reacciones de la pirosecuenciación, y si se añadiera el mismo para detectar si el nucleótido correspondiente es adenina, actuaría como sustrato y esto afectaría en el resultado.

¿ Por qué dan problemas de interpretación los homopolímeros ? Un homopolímero es una repetición consecutiva de un mismo nucleótido en la cadena molde. Ya que el pirograma permite interpretar la cantidad de nucleótidos iguales añadidos por una altura proporcional a esta,se esperaría que en una repetición larga el pico fuera muy alto. El problema es que, cuando se trata de repeticiones desde unos 6-8 nucleótidos, la proporcionalidad del pico se pierde y resulta difícil interpretar los resultados. Esto puede dar lugar a introducción de mutaciones del tipo deleción o adición....