Skript und Protokollfragen Online Versuch1-2021_Mikrobiologie PDF

Preview

Summary

Versuch 1: Grundtechniken der MikrobiologiePraktikumsort Universität Potsdam, Golm, Karl-Liebknecht-Str. 24/25, Haus 25, A0-BetreuerInnen Prof. Dr. Elke Dittmann, Tel. 0331-977 5120, editt@uni-potsdamDr. Arthur Guljamow, Tel. 0331- 977 5363Julia Krumbholz, Rebecca Große, Markus HeuserProtokolle, Fra...

Description

Versuch 1: Grundtechniken der Mikrobiologie

Praktikumsort Universität Potsdam, Golm, Karl-Liebknecht-Str. 24/25, Haus 25, A0.27-30 BetreuerInnen Prof. Dr. Elke Dittmann, Tel. 0331-977 5120, [email protected] Dr. Arthur Guljamow, Tel. 0331- 977 5363 Julia Krumbholz, Rebecca Große, Markus Heuser Protokolle, Fragen etc. richten Sie bitte an: [email protected] Benötigte Materialien Skript und Schreibutensilien, Bleistift, Taschenrechner, Kittel Ziel Dieser Versuchskomplex soll in grundlegende Techniken mikrobiologischen Arbeitens einführen. Allgemeines Mikrobiologische Arbeitstechniken unterscheiden sich teilweise stark von denen anderer Wissenschaftsdisziplinen. Dies hängt mit den geringen Dimensionen von Mikroorganismen (MO), ihrer Ubiquität und Konzentration zusammen. Absolute Priorität hat die Sterilarbeit. Dieses bezieht sich auf die Sterilität von Medien, Gerätschaften und den Arbeitsprozess selbst. Damit wird ausgeschlossen, dass es zu unerwünschten Kontaminationen kommt und sich andere als die gewünschten MO vermehren. Die Anzucht erfolgt auf speziellen Medien, die eine entsprechende Zusammensetzung haben. Diese sind auch eine Voraussetzung für die Herstellung von Reinkulturen. Letztendlich können Reinkulturen durch Verdünnung gegebener Mischpopulationen gewonnen werden. Kulturverfahren können auch eingesetzt werden, um Bakterienkonzentrationen zu bestimmen (indirekte Methode). Ein bestimmtes Spektrum an Mikroorganismen wächst im Gegensatz zu anderen Organismen ausschließlich unter Sauerstoffabwesenheit; hier müssen spezielle Anaerobentechniken angewendet werden. Natürlich gehört zu den Grundtechniken auch die Sichtbarmachung der Mikroorganismen. Cyanobakterien haben eine Eigenfärbung. Viele andere Mikroorganismen hingegen müssen angefärbt werden. Die so genannte Gramfärbung hat sogar wesentliche taxonomische Bedeutung erlangt. Bitte beachten Sie, dass jedes Kulturgefäß (z.B. Agarplatten) mindestens mit Datum, ihrer Gruppe, der Versuchsnummer/-bezeichnung und dem verwendeten Mikroorganismus beschriftet werden muss.

1

1. Übertragungstechnik Kulturen: Micrococcus luteus (Bakterienagar-BA), Rhodotorula rubra (= Rhodotorula mucilaginosa) (Malzagar-MA), Aspergillus niger (Malzagar-MA).  

 







Beschriften Sie ein Schrägagarröhrchen, das frisches Medium enthält. Platzieren Sie die Beschriftung auf der Rückseite, gegenüber von der Agaroberfläche. Nehmen Sie dieses Röhrchen und das, welches die zu übertragende Kultur enthält in eine Hand (Handballen, Zeige- und Mittelfinger; Handballen, Ring- und kleiner Finger; beide durch Daumen gestützt). Nehmen Sie die Impföse in die andere Hand (Daumen, Zeige- und Mittelfinger, wie einen Stift; Ring- und kleiner Finger bleiben frei). Halten Sie die Impföse steil in den unteren Teil des oberen Kegels einer Bunsenbrennerflamme bis die Öse glüht. Lassen Sie diese innerhalb des sterilen Arbeitsbereichs wieder abkühlen. Umfassen Sie mit Ring- und kleinem Finger den Verschluss des Röhrchens mit der Originalkultur und öffnen Sie es an der Flamme. Flammen sie den Rand des Röhrchens kurz ab und entnehmen Sie mit der Öse etwas Impfmaterial. Flammen Sie das Röhrchen wieder kurz ab und verschließen Sie es. Öffnen Sie das andere Röhrchen in gleicher Weise. Führen Sie die Öse bis ganz unten hinein und streichen Sie das Material in einer Schlängellinie bis zum Endes des Agars ab (bei Schrägagar). Achten Sie darauf, die Agaroberfläche nicht zu zerstören. Verschließen Sie wie oben das Röhrchen. Glühen Sie die Öse aus. Stellen Sie die neue Kultur in einen Brutschrank (30 °C).

2. Gewinnung einer Reinkultur (Vereinzelungsausstrich) Kultur: Escherichia coli Fertigen Sie die Verdünnungsausstriche wie hier abgebildet an (jeden Ausstrich 1x pro Arbeitsgruppe).

Variante A

Variante B

1

1

2

4

3 Variante C

1 Aus: Bast, E. (2014). Mikrobiologische Methoden (3. Aufl.). Berlin/Heidelberg. Deutschland.

2



Entnehmen Sie dazu mit einer ausgeglühten Öse wenig Material aus der vorgegebenen Flüssigkultur.

Variante A Variante B

(Normaler Aussrich) (13-Strich-Methode)

Variante C

(Sektorverfahren)



Material dicht und breit ohne Absetzen ausstreichen. Hintereinander Auftragen von drei Strichen. Öse ausglühen und nur noch das bereits aufgetragene Material aus den Schnittstellen weiter verteilen. Ausglühen. Vier Sektoren auf der Unterseite der Agarplatte markieren. Das in einen Sektor eingebrachte Material (Schlängellinie) mit der ausgeglühten Öse teilweise aufnehmen (dünner, gerader Strich) und in den nächsten Sektor übertragen, usw.

Platte bei 30 °C bebrüten.

3. Lebendkeimzahlbestimmung Kultur: E. coli 





Verdünnen Sie die vorgegebene Flüssigkultur 1:10 (10-1) indem Sie 0,9 ml sterile NaCl-Lösung (physiologisch, 0,9 % w/v) in ein steriles Eppendorf-Tube vorlegen und dann 0,1 ml Flüssigkultur zugeben (vorher unbedingt schwenken um eine homogene Bakterienkultur zu erhalten!). Verdünnen Sie auf diese Weise von Eppendorf-Tube zu Eppendorf-Tube weiter auf 10-9 (sog. geometrische Verdünnungsreihe). Pipettieren Sie je 0,1 ml von den Verdünnungsstufen 10-4 bis 10-9 auf die Agaroberfläche und verteilen Sie die Flüssigkeit mit einem sterilen (abgeflammten) Drigalski-Spatel. Bebrüten Sie die Platten 24 h bei 37 °C.

4. Untersuchung der Mikroorganismenflora in einem Habitat Ihrer Umgebung 

Testen Sie nun die Mikroorganismenflora in einem Habitat ihrer Umgebung jeweils unverdünnt.

Gruppe 1 Gruppe 2 Luft im Türklinke Praktikumsraum

Gruppe 3 Speichel

Gruppe 4 Hof

Gruppe 5 Toilettenbürste

Gruppe 6 Seifenspende r (Toilette)

Gruppe 7 Abdruck Geldstück

 Lassen Sie die Platte geöffnet für ca. 1-2h an dem jeweiligen Ort stehen  Verschließen Sie die Platte mit Parafilm  Bebrüten Sie die Platten für 24h bei 37°C 5. Anaerobentechnik 3

Kulturen: Pseudomonas fluorescens, Clostridium spp., Serratia marcescens Stichkultur  Entnehmen Sie mit der ausgeglühten Impfnadel etwas Material aus einer Bacillus subtilis Kultur. Überführen Sie es in ein Hochschichtröhrchen durch möglichst senkrechtes Einstechen in den Agar. Achten Sie darauf, den Agar nur mit dem sterilen Teil der Impfnadel zu berühren.  Wiederholen Sie das mit einer Clostridium-Kultur.  Bebrütung 24 h bei 30 °C.

Chlostridium

Modifizierte Fortnerplatte  Schneiden Sie mit einer abgeflammten Lanzettnadel einen dünnen Agarstreifen aus, so dass die Oberfläche in 2 Bereiche getrennt ist (1/3; 2/3).



 

Serratia

Tragen Sie mit der ausgeglühten Impföse Serratia marcescens in dichter Schlängellinie auf den großen Sektor auf und Clostridium als Strich in den kleinen Sektor. Legen Sie den Deckel auf und verschließen Sie die Platte zweimal mit „Parafilm“. Bebrütung 24 h bei 30 °C.

6. Mikroskopie von Cyanobakterien Kulturen: Anabaena sp PCC7120, Microcystis aeruginosa PCC7806 Mikroskopieren Sie die beiden cyanobakteriellen Präparate Identifizieren Sie für beide Präparate einen möglichst repräsentativen Bildausschnitt und fotografieren Sie diesen!  Diskutieren Sie charakteristische Merkmale für beide Cyanobakterienarten und nehmen Sie dabei insbesondere Bezug auf die Morphologie, eventuelle Färbung und subzelluläre Strukturen. 7. Färbungen und Mikroskopie 4  

Kulturen: E. coli, Staphylococcus aureus Methylenblaufärbung  Ein wenig der E.-coli-Flüssigkultur auf einem fettfreien Objektträger verreiben, lufttrocknen und hitzefixieren. Dazu den Objektträger mit Ausstrich nach oben dreimal im Halbkreis über die Bunsenbrennerflamme ziehen (Cornett-Pinzette), aber nicht hindurch. Die Bakterien dürfen nicht verbrennen.  Objektträger auf Färbeschale legen, Ausstrich mit Methylenblaulösung bedecken, 6 Minuten einwirken lassen.  Farbstoff abgießen, mit LTW spülen (den Flüssigkeitsstrahl niemals direkt auf die Bakterien richten, sondern daneben aufkommen lassen), lufttrocknen (kann durch Ablöschen mit Filterpapierstreifen unterstützt werden).  Trockene Präparate (ohne Deckglas) mit einem Tropfen Immersionsöl versehen und mit 100facher Objektvergrößerung betrachten.  Objektiv anschließend mit Roti-Histol reinigen. Gramfärbung  Stellen Sie einen Objektträger mit jeweils einem Tropfen der 3 folgenden Flüssigkulturen her.

E. coli

  

     

E. coli + S. aureus

S. aureus

Trocknen und hitzefixieren Sie die Bakterien (siehe Methylenblaufärbung) Mit Karbol-Gentianaviolett bedecken, 1 min einwirken lassen, abgießen. Mit Lugol’scher Lösung spülen (den Flüssigkeitsstrahl niemals direkt auf die Bakterien richten, sondern daneben aufkommen lassen), 1 min einwirken lassen, mit Leitungswasser wegspülen. Lufttrocknen Mit Ethanol (96%ig) entfärben Mit 1% igem Safranin gegenfärben (2 min), mit LTW spülen Lufttrocknen Trockene Präparate (ohne Deckglas) mit einem Tropfen Immersionsöl versehen und mit 100facher Objektvergrößerung betrachten. Objektiv anschließend mit Roti-Histol reinigen.

5

Protokoll zum Versuch 1: Grundtechniken der Mikrobiologie, 2021 Datum: 25.03.2021 Namen, Matrikelnummer: 1.: Linda Freisleben, 801201 BIW Verwenden Sie bitte blaue Schriftfarbe für das Protokoll. Die Fragen bleiben bitte in schwarz. Sie können Ihre Protokolle wahlweise in Gruppenarbeit mit höchstens einem/r weiteren an diesem Praktikum teilnehmenden Studierenden erstellen. Sollten Sie diese Option wählen, vermerken sie bitte auf allen Protokollen (zu Versuch 1 und 2) die Namen und Matrikelnummern beider Teilnehmenden! Selbstverständlich können Sie die Protokolle auch in Einzelarbeit anfertigen, dann wird jedem Protokoll nur ein Name zugeordnet. Bitte beantworten Sie für das Protokoll alle hier aufgeführten Fragen in der angegebenen Reihenfolge und direkt unter den Teilfragen. Wo dies vorgesehen ist, fügen Sie bitte die in der Auswertung zusammengetragenen Ergebnisse in die jeweiligen Tabellen ein. Senden Sie die Protokolle (als Word- oder pdf-Dokument) ausschließlich per Mail an: [email protected] Sie werden zeitnah eine Eingangsbestätigung bekommen. Sollte dieses nicht geschehen, so kontaktieren sie uns bitte- dann ist das Protokoll u.U. nicht angekommen. Sollten die Protokolle inhaltlich ungenügend sein, werden Sie eine kommentierte Fassung mit der Bitte um Korrektur zurückerhalten. Sie haben dann ein Mal die Möglichkeit, eine korrigierte Fassung nachzureichen, welche dann den Ansprüchen genügen muss.

Abgabetermin bis einschließlich: 02.05.2021

6

Protokollfragen Allgemeine Fragen 

Nennen Sie 3 Einteilungsmöglichkeiten für Nährmedien.

Natürliche und künstliche Nährmedien, feste und flüssige Nährmedien, selektiv– und Komplexmedien 

Was ist Pepton? Wie wird es hergestellt?

Es besteht aus einem Gemisch aus Aminosäuren und Peptiden, die aus tierischen oder pflanzlichen Proteinen entnommen werden und ist eine Misch-Form von künstlichen und natürlichen Nährmedien. 

Woraus besteht Agar und woraus wird er gewonnen? Welche 2 wesentlichen Vorteile hat er gegenüber Gelatine?

Agar besteht aus komplex verknüpften Polysacchariden und wird aus verschiedenen Rotalgen gewonnen. Agar ist im Gegensatz zu Gelatine thermostabil, nicht abbaubar und kein Protein, dadurch wachsen die angesetzten Bakterien nur auf der Oberfläche des Nährmediums. Fragen zu den Versuchen 1. Übertragungstechnik a) Nennen Sie 5 wichtige Merkmale, die die von Ihnen verwendeten Organismen charakterisieren (z.B. Art des Organismus, Zellform, Vorkommen, industrielle Verwendung, …). Micrococcus luteus: -

Sogenannter „Luftkeim“ Grampositiv, aerob Nicht krankheitserregend Gelb-gefärbte Kolonien auf Nährmedium Kokken, rund bis oval

Rhodoforula ruba: -

Hefepilz In Außenluft, Böden, Oberflächenwasser, Milchprodukte Rote bis orangefarbene Kolonien auf Nährmedium Glattes und wachsartiges Aussehen Biotechnologische Herstellung von Carotinoiden (durch rote Farbe)

Aspergillus niger: -

Sogenannter „Schwarzschimmel“ Häufiger Schimmel auf verdorbenen Lebensmitteln und im Erdboden Bildet Myotoxine Kann gesundheitsschädlich sein Biotechnologische Herstellung von Citronensäure 7

b) Nach dem Übertragen einer Bakterienkultur auf ein Schrägagarröhrchen und anschließenden Bebrütung bleibt der Impfstrich leer. Was könnte die Ursache sein? Bitte nennen sie mindestens 3 Gründe! falsche Temperatur und zu heiße Impföse, wodurch die Bakterien abgestorben sind falsche Begasung falsches eingesetztes Antibiotikum

2. Gewinnung einer Reinkultur a) Worauf beruht das Prinzip des von Ihnen durchgeführten Verfahrens zur Gewinnung einer Reinkultur? Die erfolgreicheren Verfahren basieren auf dem Verdünnen der aufgetragenen Zellmenge. Bei höherer Verdünnung steigt die Wahrscheinlichkeit, dass sich vereinzelt Kolonien bilden können. b) Bewerten Sie den Erfolg Ihrer Tätigkeit! Von den drei angewandten Verdünnungsausstrichtechniken erwies sich das Sektorverfahren (Variante C) am erfolgreichsten. Nur auf dieser Petrischale konnten einzelne Kolonien aus den beiden Bakterienarten der Mischkultur beobachtet werden. c) Bitte erklären Sie kurz, was Sie bei ausbleibendem Erfolg verändern müssten! Mittels einer höheren Verdünnung kann die Wahrscheinlichkeit erhöht werden, dass sich einzelne Kolonien bilden. 3. Lebendkeimzahlbestimmung, indirekte Methode a) Zählen Sie die erhaltenen Bakterienkolonien aus und notieren Sie die Zählergebnisse! Kolonien pro Platte in Stufe 10-6

10-7

10 -8

10-9

KBE pro ml E. coli Ausgangskultur bei 106

53

6

1

0

530*106

b) Errechnen Sie aus den Werten, die zwischen 10 und 250 Kolonien pro Platte liegen die Bakterienkonzentration (Koloniebildende Einheiten (KBE) pro ml Ausgangssuspension) unter Berücksichtigung der Verdünnungsstufe und des Auftragsvolumens. Koloniebildende Einheiten (KBE) = (n * 10) / VF n = Koloniezahl VF = Verdünnungsfaktor

8

KBE = (53*10 ml) / 106 = 530*106 *ml-1

4. Untersuchung der Mikroorganismenflora in einem Habitat Ihrer Umgebung a) Vergleichen sie die Mikroorganismenflora der ausgewählten Habitate auf den Agarplatten, bestimmen Sie dazu die Anzahl und „Vielfalt“ der Kolonien und tragen Sie diese in die folgende Tabelle ein! „Vielfalt“ ist hier ein Maß dafür, wie viele Kolonietypen auf einer Agarplatte zu finden sind, die sich in Form, Farbe, Größe, Beschaffenheit etc voneinander unterscheiden lassen.

Laborluft

Klinke

Speichel

Hof

Toilettenbürste

Seifenspender

Geld

Anzahl

4

0

15

22

1000

1000

1

Vielfalt

2

0

4

5

1

1

1

b) Erklären Sie wie mögliche Unterschiede zustande kommen! Geld, Klinke und Laborluft enthalten die wenigste Anzahl und Vielfalt an Mikroorganismen. Dies wird mit der aktuellen Situation zusammenhängen, wodurch Bereiche, die oft berührt werden, häufig desinfiziert werden und somit Mikroorganismen unschädlich gemacht werden. Toilettenbürste und Seifenspender weisen eine hohe Anzahl an Mikroorganismen auf, was darauf schließen lässt, dass sie noch nicht gesäubert wurden. Die Vielfalt ist jedoch gering, was dadurch erklärt werden könnte, dass die Hauptmikroorganismen im Toiletten Bereich Darm und Fäkalbakterien sind. Speichel und Hof enthalten die höchste Vielfalt von Mikroorganismen, weil hier viele Lebewesen und Nahrung hingelangt und sich Mikroorganismen am Besten verbreiten können.

5. Anaerobentechnik a) Bakterien werden üblicherweise hinsichtlich ihres Sauerstoffbedürfnisses in Gruppen eingeteilt. Bitte geben Sie diese Gruppenbezeichnungen hier an! aerobe, obligat anearobe, fakultativ anaerob und mikroaerophile b) Erklären Sie das Prinzip der beiden Versuche- „Stichkultur“ und „Modifizierte Fortnerplatte“ zur Herstellung der Sauerstofffreiheit in den Gefäßen. Ordnen Sie dabei Pseudomonas und Clostridium hinsichtlich ihrer Sauerstoffbedürfnisse ein! „Stichkultur: Kultur von Mikroorganismen in Kulturröhrchen, die fast vollständig mit festem Nährboden, z.B. Nähragar gefüllt sind ( Hochschichtkultur). Die Beimpfung erfolgt durch senkrechtes Einstechen des Impfdrahtes. An der Oberfläche des Nährbodens herrschen aerobe Bedingungen; zum Boden nimmt die Sauerstoffkonzentration ab. Dadurch lässt sich in der Stichkultur die Sauerstoffbedürftigkeit von Mikroorganismen feststellen. Stichkulturen dienen auch zum Aufbewahren anaerober (aber nicht O 2empfindlicher) Mikroorganismen“ (Quelle: https://www.spektrum.de/lexikon/biologiekompakt/stichkultur/11297) 9

Modifizierte Fortnerplatte: Ein Bereich des Agars in einer Agarplatte wird entfernt. Es entstehen zwei getrennte Bereiche auf der Platte (eine 3/4 große und eine 1/4 große). Der Große Teil wird mit einer Kultur großflächig beimpft, der andere Teil mit einer anderen Kultur mit nur einem Strich. Die Agarplatte wird dann geschlossen und mit luftdichtem Parafilm luftdicht verschlossen. Pseudomonas bildet sich an der Oberfläche der Stichkultur und ist somit obligat aerob. Clostridium bildet sich im Stickkanal der Stichkultur und ist somit anaerob.

c) Wie kann es zu einem Bakterienwachstum an der Agaroberfläche bei der Stichkultur von Clostridium kommen? - Die Impfnadel wurde zu weit in die Agarröhrchen eingestochen und der Schaft verunreinigte die Oberfläche - Es wurde keine Reinkultur von Clostridium genutzt, sondern eine Anreicherungskultur und fremde aerobe Mikroorganismen haben sich an der Oberfläche vermehrt

6. Mikroskopie von Cyanobakterien a) Beschriften Sie die von Ihnen angefertigten mikroskopischen Aufnahmen der beiden Cyanobakterien Anabaena sp PCC7120 und Microcystis aeruginosa PCC7806! Kennzeichnen Sie verschiedene Zelltypen bzw. subzelluläre Strukturen! Zur Beschriftung werden dünne, waagerechte Linien, ausgehend vom zu beschriftenden Teil, zur rechten Seite gezogen. Diese Linien dürfen sich nicht überschneiden und enden alle auf gleicher Höhe. Die Beschriftung erfolgt am Ende der Linien (aber nicht auf den Linien).

10

7. Gramfärbung a) Was wird mit der Anfärbung von Bakterien beabsichtigt? - Sichtbarmachung von Bakterien - taxonomische Bestimmung von Bakterien in gramnegativ oder -positiv b) Erklären Sie den strukturellen Hintergrund der Gramfärbung genauer! Welcher Bestandteil der bakteriellen Zellhülle ist im Wesentlichen für die unterschiedlichen Färbeergebnisse bei gramnegativen und grampositiven Bakterien verantwortlich? Die bakterielle Zellwand enthält Murein bzw. Peptidoglycan, dass bei der Gramfärbung rot erscheint und damit auf gramnegative Bakterien hinweist. c) Kategorisieren Sie die beiden verwendeten Bakterien Staphylococcus aureus und Escherichia coli hinsichtlich Ihrer Zellform (Morphologie)! d) In welche der beiden Gram-Kategorien (grampositiv und gramnegativ) würden Sie die verwendeten Bakterien einordnen? Begründen Sie Ihre Entscheidung unter Einbeziehung der mikroskopischen Aufnahmen der durchgeführten Gramfärbung beider Bakterienspezies! Staphylococcus aureus: grampositives, kugelförmiges Bakterium. Es erschien nach der GramFärbung lila-blau. Escherichia coli: gramnegatives, gerade zylindrische Stäbchen mit runden Enden. Es erschien nach der Gram-färbung rot.

Literatur Bast, E.: Mikrobiologische Methoden. Spektrum 2001 Fuchs, G. (Hrsg.): Allgemeine Mikrobiologie (Schlegel). Thieme 2007 Madigan, M.T.; Martinko, J.M.: Brock Mikrobiologie. Pearson 2003 Schröder, H.: Mikrobiologisches Praktikum, VWV 1990 Wistreich, G.A...