Tema 3. Cromatografía PDF

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Tema 3: Cromatografía Es un método de separación de moléculas haciendo que se distribuyan de forma diferente en dos fases: la fase móvil (que se desplaza durante la cromatografía) y la fase estacionaria (que no lo hace).

Cromatografía convencional Consiste en una columna de vidrio con un filtro en la parte inferior que permite el paso la fase móvil (tampón) pero retiene la fase estacionaria. Si se grafica la concentración de las moléculas con respecto al volumen de elución o al número de fracción, se consigue el perfil de elución de la cromatografía. El volumen de elución de una molécula (soluto) es el volumen o la fracción al que eluye el máximo de ese soluto. La cuantificación de la concentración de las moléculas se suele realizar mediante electroscopia de las diferentes fracciones: la máxima absorbancia se corresponderá con la máxima concentración. Sin embargo, también se puede realizar mediante actividad enzimática o radiación. Normalmente, el proceso de la cromatografía está automatizado: el tampón entra desde un vaso de precipitados que está a una altura mayor que la columna de cromatografía, que se encuentra sellada; en la parte de abajo, una bomba peristáltica succiona el líquido generando la presión negativa necesaria para que siga entrando tampón; finalmente, el líquido pasa por un espectrofotómetro de flujo continuo y cae en los tubos situados en un colector de fracciones La bomba peristáltica funciona gracias al efecto Venturi: posee unas ruedas que van presionando la cánula que lleva el líquido, lo que hace que aumente su velocidad y se genera la presión negativa. La diferente distribución de las moléculas entre la fase móvil y la estacionaria se puede deber a diferencias de tamaño y/o peso, carga o solubilidad.

Cromatografía de penetrabilidad o gel filtración La diferente distribución se debe a la mayor o menor penetrabilidad de moléculas dentro de un gel reticulado de partículas de sílice según su tamaño o peso. Las partículas pequeñas pueden penetrar en los poros de esta matriz, por lo que tardarán más tiempo en recorrer la columna que las grandes.

El intervalo de fraccionamiento de este tipo de cromatografía va desde el diámetro del poro más pequeño al del poro más grande y determina la probabilidad de que una determinada molécula entre en el poro. El volumen de exclusión o volumen vacío (Vo) es el volumen de elución de una partícula que no interacciona con la fase estacionaria. Representa el volumen a partir del cual se puede empezar a recoger muestra. En este punto eluirán todas las moléculas que no interaccionan con la fase estacionaria. El volumen total (Vt) es el volumen de elución de una partícula que interacciona completamente con el gel. También se puede calcular como el volumen que contiene la columna, pero esta medida representa cierto error ya que habría que restar el volumen de la fase estacionaria. Al igual que el volumen de exclusión, también puede contener varias moléculas. Finalmente, el volumen de elución es el volumen en que eluye el máximo de una determinada molécula. En ocasiones, puede aparecer un pico más allá del volumen total. Este se corresponde con alguna molécula que ha quedado retenida en la fase estacionaria no por su tamaño sino por su interacción con ella, por lo que la cromatografía puede ser errónea.

Aplicaciones La mayor parte de las veces, la cromatografía se usa como una técnica preparativa, pero en ocasiones se puede usar como analítica:  

Separación de moléculas de diferente tamaño en condiciones nativas. Cálculo de masas moleculares (analítica): se utiliza un conjunto de proteínas (de forma similar entre ellas y a la proteína problema) de las que se conoce la masa y que caen dentro del intervalo de fraccionamiento de la columna. Se realiza una recta con el logaritmo de la masa de estas respecto a su volumen de elución. Se hace pasar la proteína problema por la misma columna y en las mismas condiciones y se utiliza el volumen de elución para extrapolar la masa a partir de la gráfica. El coeficiente de reparto (Kav) permite estandarizar el volumen de elución en función del tamaño de la columna, y así poder calcular

la masa de la proteína problema a partir de una columna diferente a la que se ha usado para hacer la recta. Esta cromatografía sirve tanto para observar la pureza de la muestra como para determinar si el tamaño de la molécula coincide con lo que se esperaba.

Kav  



Ve  V 0 V t V 0

Desalado de muestras o cambio de disolvente: tras purificar una molécula, esta acaba disuelta en un determinado medio que puede no ser el óptimo para continuar con el proceso de interés. Todas las moléculas que contendrá este medio (como sales del tampón) son mucho más pequeñas que la proteína. Se hidrata la fase estacionaria con el tampón que interese (o agua) y se hace pasar la muestra por la columna, de forma que las sales quedarán retenidas en las bolas y la proteína eluirá en el medio que hidrataba la fase estacionaria. Este proceso también puede hacerse sin cromatografía, mediante un saco de diálisis (que permite el paso de sales, pero no de macromoléculas) introducido en el tampón de interés: las sales de ambos tampones se irán intercambiando a través de la membrana del saco. Este proceso, sin embargo, es más lento y menos efectivo. Determinación de la pureza: si la molécula que se separa es pura, se genera un pico simétrico. En cambio, si este es asimétrico, se debe a que está formado, en realidad, por dos picos, bien por cierta degradación de la proteína o por contaminación por parte de proteínas similares. Este hecho hace que la cromatografía pueda utilizarse al final de un protocolo de purificación para comprobar la pureza de la muestra obtenida.

Además del intervalo de fraccionamiento (que hace referencia al diámetro de los poros), para definir una columna cromatografía es importante el diámetro de la partícula (de las bolas, no del poro). Siempre es mejor utilizar partículas pequeñas, porque dejan más espacios entre ellas, por lo que cada ml de fase móvil ocupará menos longitud de la columna, es decir, las proteínas eluirán en un menor volumen (más concentradas). También es importante el tipo de polímero de la fase estacionaria ya que, por lo general, los naturales son menos agresivos.

Cromatografía de intercambio iónico Puede ser de intercambio:  

Catiónico: retiene cationes. Aniónico: retiene aniones.

La columna contiene un soporte cromatográfico (esfera inerte), también llamada resina intercambiadora, que lleva unidos grupos con carga (la fase estacionaria), que son los que interaccionan con la muestra.

Normalmente se usa para separar proteínas o DNA, ya que son las biomoléculas que poseen carga. La carga de la proteína se realiza a baja fuerza iónica o al pH que hace que la carga de la proteína sea la que interesa. Para eluir la proteína se aumenta la fuerza iónica o varía el pH. Un intercambiador fuerte es aquella molécula que se hace servir como fase estacionaria y que mantiene su carga en un rango de pH alto, de forma que, al cambiar el pH del medio para eluir la molécula que está unida, el intercambiador no cambie su carga y por tanto la molécula permanezca unida. La elución puede ser:   

Isocrática: el pH siempre es el mismo. Escalonada o de gradiente discontinuo: el pH o la fuerza iónica se va aumentando de forma discreta. Gradiente continuo: el aumento del pH o la fuerza iónica es continuo. Esto permite que las proteínas se separen mejor, es decir, pueden separarse picos que formaban uno solo. Cuanto menor sea la pendiente del gradiente en que aumenta la concentración, más separados estarán los picos. La disminución de esta pendiente se puede lograr de dos formas: centrándose en la parte del gradiente en que eluyen las proteínas o aumentando el volumen de la cromatografía.

Mezcla de proteínas con pI próximos En un intercambio catiónico: Como los pI están muy próximos, o se enganchan todas las proteínas o ninguna. La situación más óptima es la primera, ya que de lo contrario eluirían todas las proteínas juntas. Para que interaccionen con la fase estacionaria, las proteínas deben ser positivas, por lo que el pH de la cromatografía debe ser menor que sus pI. Por otro lado, cuanto más lejos esté el pI de una proteína del pH de la cromatografía, más cargas + tendrá y más fuertemente se unirá a la fase estacionaria. Por lo tanto, para

eluir las proteínas, se utiliza un gradiente creciente y continuo de fuerza iónica, de forma que irán eluyendo las proteínas en orden creciente de pI (primero las que están unidas más débilmente a la fase estacionaria). Mezcla de proteínas con pI diferentes En un intercambio catiónico de tres proteínas (pI(A)...