Tema 8. La tecnología de Luminex PDF

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Apuntes con los que obtuve una calificación de 9.7 (Sobresaliente) con el profesor José A. Horcajadas Almansa....

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Tema 8: La tecnología de Luminex Introducción Actualmente: Más de 7,000 Luminex se encuentran laboratorios privados y públicos, instituciones académicas, compañías farmacéuticas, instituciones médicas y hospitales.  

Más de 50 colaboradores 91 Patentes cerradas y 218 pendientes

Tres tipos de plataformas Tratan de llegar fácilmente a todo el mundo

Historia de luminex

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La tecnología de Luminex -

Se busca ahorrar tiempo, volumen y dinero

Se utilizan las siguientes tecnologías:

(Examen) Análisis de componentes principales no, sería una tecnología que no se utiliza

Aplicaciones -

Ensayos con ácidos nucleicos: copy number variation y SNPs Ensayos receptor-ligando Ensayos enzimáticos Inmunoensayos

 Se utiliza Diagnóstico in vitro y en Investigación  Es importante Rapidez, coste/efectividad, precisión

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Componentes

Funcionamiento de la técnica Luminex La tecnología X-MAP Luminex (a partir de ahora Luminex) es una multitecnología que permite el análisis simultáneo de un gran número de bioensayos sacados de un pequeño volumen de muestra, normalmente una gota, a través de leer test biológicos en la superficie de unas microesferas de poliestireno. Esta tecnología oferta la lectura de 96 pocillos y 100 analitos. Además, posee una alta productividad y ahorro, ya que reduces en tiempo, en reactivos, en volúmenes y en costes en general (sólo que te tienes que comprar el aparatito). La tecnología luminex está basada en la citometría de flujo, desde el momento en que las microesferas se onducen por microcapilares y son detectadas, además usa láseres y un procesador de señal digital para poder interpretar los datos. Debido a su rapidez, su bajo costo, efectividad y precisión, se está usando mucho para ensayos con ácidos nucleicos, ensayos de receptor-ligando, enzimáticos e inmunoenayos con dos objetivos: la investigación y el diagnóstico in vitro. Los componentes de la tecnología luminex son los siguientes: -

Microesferas (que van a ser los analitos en sí de la técnica) Reactivos biológicos. Fluidos. Óptica Procesamiento digital de datos

El array es fijo, las sondas son fijas, en el caso del Luminex, son bolas en suspensión, bolas que están flotando en un líquido. ¿Cómo se distinguen las bolitas?  Mediante combinación de fluoróforos.

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1. Microesferas Las microesferas consisten en partículas de poliestireno altamente uniformes que se han entrecruzado durante la polimerización para obtener estabilidad física y térmica. Posee una superficie carboxiladas, tamaño de 5.6 micras, se suspenden en líquidos, poseen una cinética rápida y poseen una alta relación superficie/volumen. Estas microesferas están teñidas. Estas teñidas con dos colorantes (Rojo e IR) en distintas proporciones, de tal forma que cada microesferas pertenece a un grupo específico que se identifica con un único número ID. Esto es lo que nos va a permitir después seleccionar las esferas, por ejemplo: IL6, IL8… Tienene una superficie carbolxilada que permiten pegar sondas, olignucleotidos, bacs, sondas, anticuerpos. Lo mismo que los arrays 1) Las microesferas consisten en partículas de poliestireno altamente uniformes que se han entrecruzado durante la polimerización para obtener estabilidad física y térmica. - Superficie carboxilada - Tamaño pequeño de las esferas (5.6 micras) o Suspensión en líquidos o Cinética rápida o Alta relación superficie/ volumen 2) Tinción Se usa una combinación de dos colorantes (IR, Rojo) Todas las esferas que tienen una relación particular de color pertenecen a un grupo específico que se identifica con un único número ID. Lo que se hace es añadir diferentes concentraciones de diferentes fluoróforos. Lo que hay que hacer es asignarle a cada uno una molécula. Vamos a suponer que tenemos 100 genes, lo que se hace es lo siguiente se llama a Luminex y se piden 100 bolitas, te manda 100 tubos con las bolas de la 1 a la 100 con diferentes concentraciones de fluoróforos. Ya vienen teñidos. Tienen la superficie preparada para añadirle cosas. Para analizar la expresión génica supongamos 100 genes, cogemos la bola 1 y por reacción química pegamos los oligonucleótidos, lavamos los oligos que no se han pegado y ya está. Con la segunda bola igual, pegamos los oligonucleótidos para el gen 2, en la bolita tres iguales para el gen 3, y así sucesivamente. Se pueden poner cualquier cosa unida a las bolitas. Añades de esos 100 por separado, se junta, y los tendremos mezclados en la misma proporción

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3) Selección de esferas 4) Sondas Ahora lo que hago es marcar mi ADN y unirlo a las bolas. Tengo 3 tipos de fluorescencia, 2 que me identifican la bola y 1 que es mi ADN que me indica cuanto ADN se ha pegado a la bola.

2. Muestras Las microesferas están cubiertas de algún tipo de molécula que va a tener una especificidad de unión con el analito que nosotros queremos cuantificar. Normalmente van a existir anticuerpos monoclonales. Lo que ocurre es que nuestro analito se une al anticuerpo, después se lavaría y se quitarían todos los que no se han unido. Después se añade otro anticuerpo y tendríamos un sándwich: anticuerpo-analito-anticuerpo. Por último, se añadiría una molécula que fuese capaz de excitarse con luz y que se pegase al segundo anticuerpo monoclonal. No tiene por qué ser sólo anticuerpo monoclonales, como se ve en la siguiente foto:

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Para analizarlo, como son bolitas, mediante citometría de flujo, las bolitas van pasando, porque no cabe más de una, por un citómetro. Las bolitas van pasando de una en una y se van analizando. Los ensayos se hacen en una placa similar a las de ELISA. Se ponen en la maquina, lo que hace la maquina es chupar, absorbe todas las bolas, las va mandando hacia arriba, y las analiza con los dos láseres.

3. Lectura Una vez que tenemos nuestra placa de 96 pocillos con todas nuestras muestras biológicas, ésta es introducida dentro de la máquina de Luminex y comienza la lectura. Primero se realiza una aspiración de las muestras con una jeringa con un caudal de 1microL/s. Esto se inyecta dentro del aparato y se añade tambiñen Sheat Buffer a 90 microL/s. Esto pasa por un capilar y se permite, o se fuerza a que las microesferas pasen formando una columna muy estrecha, que estén en línea. (DE AQUÍ QUEDARSE CON QUE UNA JERINGA COGE LA MUESTRA CON BUFFER Y PASAN UNA POR UNA POR EL TUBITO QUE VA A IR AL DETECTOR). A continuación, las esferas van a ir pasando por el indentificador de microesferas. Éste está compuesto por dos láseres. (1) El primero de ellos es un láser rojo (635 nm) que actúa como clasificador, ya que excita los fluorocromos con os que se tiñeron las microesferas, se mide la proporción de los dos colorantes Rojo e IR y se identifica que clase de esfera es. (2) El segundo es un láser verde (532 nm) que actúa como identificador, va a excitar al fluorocromo que hablábamos antes que se encuentra unido a la microesfera debido a que el analito de interés de ha unido, este laser va a medir la cantidad de analito unido, mientras más haya unido, más emisión habrá cuando se ilumina con el láser. Todo esto va acompañado de detectores que son los que realmente cuantifican la cantidad y clasifican las esferas y miden la cantidad de analito unido.

Este equipo ha triunfado mucho por el precio, hay que pensar en las cosas para amortizarlas en un tiempo

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1) Aspirado de las muestras - La muestra se inyecta en el fondo de la cubeta (1ul/sec) - Se inyecta Sheat Buffer alrededor de la muestra (90 ul/sec) - La muestra forma una columna muy estrecha que fuerza a las esferas a estar en línea.

2) Identificación de las microesferas - El rojo te mide la fluorescencia que se te ha pegado. - En todos los pocillos hay las mismas bolas con los mismos oligonucleótidos, cada pocillo es como un pequeño Microarray en suspensión. EN el 1 estudio la condición 1, porque tengo la condición 1. Cada pocillo es como un pequeño Microarray en suspensión.

Examen: Principalmente se utiliza con genómica (ADN, en cantidad y calidad, podemos mirar SNPs), genómica funcional y proteómica (unión de enzimas, de ligandos).

Se discriminan los datos por tamaño.

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4. Obtención de datos El software del aparato de Luminex obtiene los datos sacados de los detectores y lo primero que hace es discriminar aquellos eventos de tamaño no conocido, es decir elimina cualquier cosa más grande o más pequeña que las microesferas. Después identifica los grupos de las microesferas, es decir agrupa todas aquellas que sean del mismo grupo, estos grupos se determinan en base a los valores de fluorescencia de los dos colorantes internos (Rojo e IR). Cada grupo de esferas se sitúa en una región específica, y si se ha detectado una esfera que no pertenezca a ninguna de las posibles regiones, se desecha esa información. Después, se analizan los datos de un mínimo de 35 microesferas por región y se calcula con la señal del fluorocromo reportero (el verde) y la superficie de la microesfera la concentración de analito, esto está basado en el cálculo de la fluorescencia media (MFI) de todos los eventos. Por último, hay un procesamiento y representación a tiempo real de los datos obtenidos de los 96 pocillos en un tiempo estimado de alrededor de 1 hora. 1) El software discrimina datos por tamaño - Son excluidos eventos mayores o menores que las esferas 2) El software identifica los grupos de esferas (1-100) -

Los grupos se determinan en base a los valores de fluorescencia de los dos colorantes internos Cada grupo de esferas cae en una región específica en el software

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No se colecta información si no caen en una región establecida

3)

El software calcula la señal del reporter sobre la superficie de la esfera -

Se analiza un mínimo de 35 esferas individuales de cada región Se calcula la intensidad de fluorescencia media (MFI) de todos los evento Cuando ha medido 35 bolas de cada una d elas bolas, corta y saca la media de fluorescencia. El software presenta los datos en tiempo real Se leen 96 pocillos en 1 hora

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Ventajas Luminex 1. LUMINEX VS ARRAYS Mejora cinética - Tiempo de lectura - Fabricación

2. LUMINEX VS ELISA - Menor tiempo de protocolo - Reducción del coste - Menor volumen de muestra

En cada pocillo están en un montón de esferas para cada gen. Tengo el pocillo 1 que contiene 100 tipos de bolas, por ejemplo estamos estudiando expresión génica. Tenemos 100 bolas para 100 genes. ¿Cuántas bolas hay?  hay miles de bolas, hay 500 bolas de cada tipo, hay muchísimas bolas. Se cogen 35, porque con 35 se calcula que tiene suficiente información para hacer estadística. Se hace el estudio y se mete en el tubo, empiezan a pasar bolas para arriba ¿Cómo saber que no coge 35 bolas de 1 solo tipo?, Te va leyendo las bolas y te va diciendo la fluorescencia. Tiene que tener 35 medidas de cada una de ellas mínimo. A lo mejor de la bola 23 se han medido 65 de la 28 se han medido 87, pero no vale se hace una media de la fluorescencia por bola. Esto es al azar, se van sacando bolas, como el sorteo del gordo. Es como la lotería del gordo, al final del sorteo, tiene que haber.

Luminex Arrays – Throughput Choices for Multiplexing Solutions

La ventaja es que se puede customizar esto, en lugar de utilizar un genoma completo con millones de sondas. Se utilizan las que a nosotros nos interesan. Se puede poner de un gen poner más copias incluso. Página 9 de 27 Luis Pedro Gª-San Segundo Jiménez. Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide. [email protected]

La fortaleza principal es el número de sondas que se puede utilizar. Los ensayos son mucho más reproducibles, se pueden hacer muchas muestras al día. Esto es unitario, pero la mayoría de los Microarrays no son unitarios.

Aplicaciones

Se puede customizar y poner lo que te dé la gana.

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Empresas / colaboradores

Empresas que utilizan esta técnica para diagnostico clínico o para investigación.

Diagnóstico de la Fibrosis Quística por Luminex® Fibrosis quística •

La Fibrosis Quística (CF) es una enfermedad crónica y hereditaria que representa un grave problema de salud. Es una de las enfermedades mortales más comunes.

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Una de cada 25 personas es portadora asintomática de una mutación para el gen de la CF.

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Se estima que la incidencia de la Fibrosis Quística en España es de un caso de cada 3500 nacidos vivos .

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En España habría entre 1,5 a 2 millones de personas portadoras del gen de la CF.

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Consiste en una alteración genética que afecta a las zonas del cuerpo que producen secreciones, dando lugar a un espesamiento y disminución del contenido de agua, sodio y potasio, originándose la obstrucción de los canales que transportan esas secreciones y permitiendo que dicho estancamiento produzca infecciones e inflamaciones en forma generalizada(2).

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La CF hoy día no tiene curación.

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Se han detectado varias mutaciones en el gen CFRT que puede afectar a la proteína de forma cuantitativa, cualitativa o ambas. Existe una relación proporcional entre la severidad de las mutaciones y la gravedad de la enfermedad.

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El cribado neonatal nos permite adelantarnos al diagnóstico antes de la aparición de síntomas de CF, que se presentan mayoritariamente en estados avanzados de la enfermedad.

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La CF es causada por una mutación en un gen que se encuentra en el cromosoma 7, llamado regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística CFTR. Es una glucoproteína de membrana de 1480 aminoácidos, que funciona como canal de cloruro regulado por AMP (Adenosín 5’ mono fosfatasa) cíclico y que se expresa casi exclusivamente en las células de los epitelios secretores.

Frecuencia de mutaciones que producen fibrosis -

Las mutaciones que causan la enfermedad se clasifican en 4 clases en función del efecto que producen en la proteína. Más útil para la biología molecular que para su uso clínico.

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En su mayoría, las mutaciones registradas para la CF son pequeñas deleciones de 1 a 84 pares de bases.

Mutación nomenclatura: G551D Cambio por aspártico, cambio de G por T, etc. Se relacionan con la parte genética o proteica

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xTAG™ Cystic Fibrosis 39/71 Kit v2 •

xTAG™ Cystic Fibrosis 39/71 Kit v2 se usa para detectar e identificar simultáneamente un panel de mutaciones y variantes en el gen CFTR en sangre humana.

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El panel incluye mutaciones y variantes recomendadas por el American College of Medical Genetics y el American College of Obstetricians and Gynecologists (ACMG/ACOG), más algunas de las mutaciones más prevalentes en el mundo y en Norte América.

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El kit xTAG Cystic Fibrosis 39/71 Kit v2 es un test de genotipado cualitativo que se usa para detectar portadores adultos en edad reproductiva, en cribado neonatal y para confirmar el diagnóstico en recién nacidos y niños.

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No está indicado para diagnóstico fetal o análisis pre-implantación.

Raza Caucásica Caucasoide, caucásico o leucodermo son términos utilizados para describir racialmente a los grupos poblacionales originarios de Europa, África del Norte y Asia Occidental. En ocasiones, algunos autores utilizan el término raza caucásica como sinónimo de "raza blanca" o viceversa, pero esta identificación es conceptualmente errónea. Recibió el calificativo de caucásica siguiendo la hipótesis de que esta raza proviene de la región del Cáucaso. La raza madre caucasoide se divide en dos grandes ramas o grupos macro-étnicos: Aria, indoeuropea, europoide o raza blanca. Germanos, eslavos, celtas, griegos, iranios, indoarios, etc. Semítica. Fenicios, cartagineses, babilónicos, hebreos/judíos, árabes, etc. Históricamente, han sido las razas mejor preparadas para crear civilizaciones, y que han logrado los más grandes avances y conocimientos científicos, junto con las razas mongoloides y rojas.

Panel

Esas 18, conseguían además de ser más efectivos, ser más baratos y además era más rápido. Hoy en día esto ha desaparecido, no se hacen screening de una sola enfermedad se hacen de muchas.

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Diagnóstico de la Fibrosis Quística por Luminex® xTAG ® Cystic Fibrosis 71 kit v2

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Se utiliza una reacción Que se basa en que cuando se la nutación no hay amplificación y cuando no esté la mutación, sí. Lo primero es creerse que se puede hacer, no importa pedir pasta, aunque haya que pasar apuros. La gente que invierte sabe que funciona. Por cada 10 ideas 1 será la que triunfe. Hay laboratorios que no están equipados que están para alumnos dirigidos por profesor para hacer

Software xTAG®: TDAS Ventajas: •

Fiabilidad: Tecnología de última generación con certificado CE ‘In Vitro Diagnostics’.

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Análisis completo: Estudio de mutaciones más completas del mercado incluyendo el panel recomendado por la ACMG (American College of Medical Genetics).

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Flexibilidad: Muestras a partir de sangre total.

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Garantía: Generación con una precisión y reproductibilidad >99,9%.

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Aprobado por la FDA.

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Genotipado completo para alelos WT y mutados, así como para variantes.

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Aprobada por la FDA es muy importante. IVD: In vitro diagnosis. Es un certificado que da Europa para que pueda utilizarse para diagnóstico RUO: Research Use Only. Principalmente solo puede utilizarse para investigación, pero en la realidad también se utilizan para diagnóstico. Especificidad y sensibilidad ya lo vimos, cae en el examen.

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Luminex en el diagnóstico prenatal Arrays en CGH

Con esto se hace estudio de embriones. CHG. Para un screening general, que quiero ver solo si están todos los cromosomas no quiero tantas sondas, por lo que hay gente que hace PCR cuantitativa ...