Tema 8. Regulació activitat enzimàtica PDF

Preview

Summary

Download Tema 8. Regulació activitat enzimàtica PDF

Description

Tema%8.%Regulació%activitat%enzimàtica:%al·losterisme%i%modificació%covalent.% ! Els!bacteris!han!de!respondre!a!canvis!de!temperatura,!pH,!concentracions!de!nutrients,!etc..! Hi!ha!dues!grans!branques!de!resposta:! - Lenta! que! implica! modificacions! de! proteïnes.! Es! pot! regular! a! nivell! de! la! síntesi! de! l’enzim!(regulació!de!l’expressió!gènica).! - La!resposta!ràpida!que!implica!el!canvi!de!l’activitat!en!els!enzims! à!canvis!al·lostèrics! que! impliquin! activitat! de! l’enzim! o! bé! modificacions! covalents.! Tots! dos,! són! canvis! reversibles.!Altres!canvis!totalment!irreversibles!són!els!de!proteòlisi.!! Els! enzims! tenen! velocitats! de! funcionament! que! depenen! de! la! quantitat! de! substrat! que! tenen!disponible.!Els!enzims!senzills!solen!tenir!només!un!centre!actiu.!! ! Regulació%al·lostèrica:!! Enzims!regulats!per!factors!específics!à!reguladors!que!tenen!efecte!directe!sobre!els!enzims.! Els!enzims!tenen!dos!llocs!actius:!a!un!se!li!uneix!el!substrat!i!l’altre!s’uneix!el!regulador.!Hi!ha! enzims!que!només!tenen!un!lloc!d’unió!à!al·losterisme!competitiu,!on!el!regulador!competeix! amb!el!substrat!pel!lloc!d’unió.! Necessiten!la!unió!covalent!d’un!efector!per!unir-se!a!la!molècula.!L’unió!de!l’efector!provoca! canvis! en!l’enzim! i! en!l’activitat.! Són! cooperatius,! és!a! dir!com! més! enzim!hi!hagi!més!enzim! s’activarà.! !El!factor!pot!ser!negatiu!o!positiu!depenent!del!control! que!exerceixi:! ! - efector!negatiu:!la!unió!de!l’efector!provoca!un! canvi! conformacional! en! l’enzim! que! impedeix! l’accés!del!substrat!al!seu!lloc!catalític.! ! - efector! positiu:! la! unió! de! l’efector! provoca! un! canvi! conformacional! en! l’enzim! que! permet! l’accés!del!substrat!al!seu!lloc!catalític.! ! ! ! Hi!ha!molts!enzims!al·lostèrics!que! poden!estar!en! vies!catabòliques!i! anabòliques.!Exemple:! aspartat% transcarbamilasa.! Aquest! enzim! està! implicat! en! la! reacció! de! síntesi! de! les! pirimidines.! Produeix! com! a! producte! final! CTP! que! posteriorment! actuarà! com! a! efector! negatiu.! Si! hi! ha! CTP! al! medi! la! km! augmenta,! i! la! velocitat! disminueix! disminuint! també! l’activitat!del!propi!enzim.!La!regulació!al·lostèrica,!per!tant,!serà!negativa!amb!la!presència!de! CTP,!i!serà!positiva!en!presència!de!ATP.! ! Respecte!les!vies!anabòliques,!són!bàsicament!regulacions!negatives.!Les! vies! que!són!!lineals! s’anomenen! feedback! simple! on! el! producte! final! és! el! que! s’encarrega! de! la! inhibició! al·lostèrica!del!primer!enzim.!Les!de!tipus!positiu!depenen!d’altres!vies!de!regulació.! ! !

Si! les! vies! no! són! lineals,! hi! ha! diferents! tipus! de! retroinhibició! amb! patrons! de! regulació! diferents:! ! - Enzims% isofuncionals:! una! via! produeix! diferents!productes! que! inhibeixen!l’activitat! de!les!primeres!reaccions,!però!en!varis!enzims!(isoenzims),!ja!que!el!primer!enzim!de! la! via! en! realitat! són! 2! o! més! isoenzims! diferents,! i! cadascun! dels! productes! finals! afecta!a!un!d’ells.! ! - Retroinhibició% acumulativa:! un!únic! enzim! que! catalitza! la! primera! reacció! respon! a! diferents!productes!finals!que!tenen!una!acció!de!inhibició!negativa,!però!cap!d’ells!és! capaç!d’inhibir!100%!l’activitat,!només!ho!fan!parcialment!(tenen!llocs!diferents!d’unió! al·lostèrica!a!l’enzim).! ! - Retroinhibició% seqüencial:! cada! producte! final! és! responsable! del! seu! feedback! negatiu,!és!a!dir,! de!la!seva!pròpia!branca!de!producció,!i!el!producte!que!té!inhibició! sobre!el!primer!enzim!és!el!primer!compost!d’aquesta!ramificació.! ! - Inhibició%més%activació:!s’utilitzen!efectors!al·lostèrics!positius!i!negatius!per!coordinar! vies! complexes.! Hi! ha! productes! d’una! via! que! són! intermediaris! d’una! altra! via.! El! primer! producte! és! ramifica,! i! el! producte! g! ve! de! dues! vies! diferents! de! reacció.! Si! s’acumula!d!té!un!efecte!positiu!per!a!que!es!pugui!produir!b.!

! Per!veure!si!un!producte!és!un!regulador!al·lostèric!negatiu!inhibidor!es!fa!un!experiment!en! un! medi! mínim! amb! glicerol! i! C14! à! tots! els! aminoàcids! de! les! seves! proteïnes! estaran! marcades!amb!carboni!14.!Es!prepara!un!altre!medi!mínim!amb!glicerol,!C14!i!un!aminoàcid,!la! metionina! à! tots! els! aminoàcids! que! s’han! sintetitzat! a! partir! del! glicerol! estaran! marcat,! i! l’únic! no! marcat! serà! la! metionina,! indica! que!si!hi!ha!metionina!al!medi,!aquesta!inhibirà!la! seva!síntesi!a!partir!del!glicerol!i!per!això!no!es!troba!marcada!(prové!directament!del!medi).!La! metionina!actua!com!a!efector!al·lostèric!negatiu.!

! Feedback!simples:% aspartat% transcarbamilasa.!La!reacció!global! és!carbamoïl!P!+!aspàrtic!à!CTP!i!altres!pirimidines.!L’acumul!de! CTP! produeix! una! inhibició! del! primer! enzim.! El! mateix! enzim! també! està! regulat! per! un! altre! factor! al·lostèric,! l’ATP! que! és! un! efector! positiu! (si! hi! ha! nucleòtids! disponibles,!se! n’han! de! produir! dels! altres)! à! model% de% inhibició% i% activació! a! la! vegada.!Amb!ATP! es! necessita!menys!concentració!de! substrat! per!arribar!a!la!velocitat!màxima.!L’ATP!i!el!CTP!comparteixen!el! mateix!lloc!d’unió.!Quan!hi!ha!l’efector!CTP!disminueix!l’activitat! i! augmenta! la! Km.! S’intenta! mantenir! equilibrat! el! nombre! de! purines!i!pirimidines.!! ! Feedback!acumulatiu!de!glutamina%sintetasa:!la!glutamina!sintetasa!és!un!punt!de!control!per! al!creixement.!Està!molt!controlada!i!regulada.!Està! present!en!els!sistemes!d’assimilació!del! nitrogen! (aquest! constitueix! el! 17%! de! pes! sec! d’E.coli)! i! en! les! rutes! biosintètiques.! També! participa!en!l’assimilació!d’amoni!quan!aquest!es!troba!en!poca!quantitat,!ja!que!és!un!sistema! que!consumeix!ATP.!! La! reacció! és:! ! ! ! glutamat! +! NH3! +! ATP! à! glutamina! +! alfa-cetoglutarat! à! glutamat.! La! glutamina! és! l’origen! de! la! síntesi! de! AMP,! CTP,! histidina,! triptòfan,! carbonil! fosfat! i! glucosamina-6-fosfat.! L’assimilació! de! nitrogen! no! pot! ser! inhibida! pels! productes! que! es! produeixen!per!a!les!vies!biosintètiques.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Isoenzims:!síntesi!de!DAHP.!L’intermediari!de!la!via!és!DAHP!(primer! producte)! i! la! reacció! ve! catalitzada! per! 3! enzims! diferents,! on! cadascun!respon!a!inhibició!negativa!per!cadascun!dels!3!productes! finals! que! es! produeixen.! El! productes! no! inhibeixen! el! mateix! enzim.!

Regulació! al·lostèrica! a! vies! catabòliques:! aquesta! regulació!té!com!a!efectors,!intermediaris!de!la!via.! Per! exemple! el! NADH,! fosfoenolpiruvat,...! L’acumulació! de! PEP! inhibeix! la! fructosa-6-fosfatquinasa!per! ta!de!no!acumular!més! PEP.!El! NADH!i! l’alfa-cetoglutarat!impedeixen!el!pas!de!oxalacetat!a! citrat.! L’ATP! i! NADH! o! derivats! són! els! efectors! de! les!vies.! La! resposta! de! la! cèl·lula! a! regular! de! manera! positiva!o!negativa!les!vies,!té!la!forma!de!la!figura! 5.!Quan!la!càrrega!energètica!és!molt!baixa,!s’activa! la! taxa! d’activitat! enzimàtica! d’aquelles! vies! que! sintetitzen!ATP!i!es!disminueix!l’activitat!de!les!vies! que! utilitzen! ATP.! Quan! la! taxa! energètica! és! elevada,! s’activen! les! vies! de! biosíntesi! i! es! disminueix!l’activitat!de!les!reaccions!catabòliques.! % % % % % % % % % % % Modificacions%covalents.% Aquestes! modificacions! causen! sobre! l’enzim! un! canvi! conformacional! que! altera! ! la! seva! activitat!(augmenten/disminueixen!l’afinitat!pel!substrat,...).!En!són!exemples!les!adenilacions,! fosforilacions,!metilacions,!uridilacions!i!acetilacions.! ! Adenilació/uridilació! de! glutamina! sintetasa.! Respon! a! una! modificació! covalent,! a! més! de! a! regulacions! al·lostèriques.! És! un! enzim! que! està! format! per! 12! subunitats! multimèriques! iguals,!que!són!susceptibles!de!ser!adenilades.!Quan!no!hi!ha!adenilació,!el!nivell!d’activitat!és! del!100%,!mentre!que!a!mesura! que!s’incrementa!AMP!més!disminueix!l’activitat!de!l’enzim.! Es! produeix! gradualment.! Quan! l’enzim! està! tot! adenilat,! és! quan! és! més! susceptible! a! una! inhibició!per!feedback!acumulatiu.!De!manera!indirecta!respon!als!nivells!de!concentració!de!la! glutamina.! La!glutamina!sintetasa!pateix!modificació!covalent!per!adenilació,!cadascuna!de!les!subunitats! té! possibilitat! de! adenilar-se.! A! mesura! que! s’incrementa! el! número! de! ADP,! disminueix! l’activitat!de!l’enzim.!Aquesta!inhibició!per!acumulació!de!productes!que!té!és!només!eficient! quan!l’enzim!és!poc!actiu.!En!el!cas!de!que!l’enzim!faci!falta!per!assimilar!nitrogen!no!té!sentit! que!estigui!inhibit.!És! un!sistema! que! depèn!de! un! conjunt!de! diversos!enzims.!El! fet!que! la!

glutamina!sintetasa!estigui!adenilada!o!no!és!un!joc!que!depèn!de!varis!enzims!i!determinats! factors!que!tenen!relació!amb!els!nivells!d’amoni!disponibles.!! Quan! hi! ha! una! concentració! d’amoni! elevada! al! medi,! s’utilitza! el! sistema! de! la! glutamat! deshidrogenasa!per!incorporar!amoni,!ja!que!aquest!sistema!no!consumeix!energia.!En!canvi! quan! al! medi! hi! ha! una! concentració! d’amoni! baixa! s’utilitza! el! mecanisme! de! la! glutamina! sintetasa,!e!qual!consumeix!ATP.!Si!l’amoni!no!és!limitat!aquest!enzim!és!necessari!per!produir! glutamina! i! altres! productes.! En! el! cas! de! que! aquests! productes! estiguessin! en! excés! es! produiria!una!inhibició!per!feedback.!

! Hi! intervenen! 4! enzims:! uridiltrasnferasa/uridilremovasa,! glutamina! sintetasa,! PII! A! /! PII! D! (regula!l’expressió!de!l’enzim),!ATPasa/adeniltransferasa.! UR/UTasa,!té!dues!activitats,!una!activitat!uridil!removasa!–!UMP!i!una!altra!de!uridiltrasferasa! +UMP.!L’enzim!que!pateix!la!modificació!és!el!PII,!aquest!pot! estar!com!a!PII!o!pot!estar!PIIUMP.!Aquí!intervé!un!altre!enzim!que! és!la!ATase! que!és! una!adenil! transferasa!que!pot!ser! +AMP! o! -AMP.! Tota! aquesta! cascada! de! regulació! respon! a! quins! són! els! nivells! d’alphacetoglutarat!o!glutamina!que!hi!ha!a!la!cèl·lula.!! En! condicions! de! nitrogen! limitant,!com! que! n’hi! ha!poc!la!glutamat!deshidrogenasa!no!és!eficient,! i!com!que!no!es!pot!cedir!el!grup!amina!a!l’alpha! cetoglutarat,! s’incrementen! els! nivells! d’alphacetoglutarat,!d’alguna!manera!el!coeficient!alphacetoglutarat-! glutamina! s’incrementa.! Quan! s’acumula!l’alpha!cetoglutarat!el!que!es!produeix! és! directament! una! inhibició! de! la! activitat! uridil! removasa! i! per! contra,! s’indueix! l’activitat! de! la! uridiltransferasa! i! això! fa! que! la! proteïna! PII! estigui! unida! a! UMP.! Això! induirà! l’activitat! de! l’adenilasa! que! transformarà! la! glutamina! sintetasa.!!

Si! el! nitrogen! és! abundant! s’acumula! la! glutamina,! per! tant! el! coeficient! alphacetoglutarat/glutamina! disminueix.! S’inhibeix! la! UTasa! i! s’incrementa! la! uridilremovasa.! Això! provoca!que! PII! no! estigui!unit! a! UMP! i! afavoreix!que! la! glutamina! sintetasa! baixi! l’activitat.! Només! quan! està! adenilat! és! susceptible! al! feed-back! negatiu,! perquè! quan! està! en! forma! desadenilada,!sense!AMP,!és!insensible!a!la!regulació!al·lostèrica.! ! Fosforilació:!un! dels! exemples! està!implicat!en! la! translocació! de! grup! on! l’enzim! pateix! fosforilacions!a!través!d’un!grup!fosfat!del!PEP!à! sistema% PTS.! Majoritàriament! es! troba! en! forma! deforsforilada.! ! L’enzim! IIA! el! podem! trobar! fosforilat! o! no,! depenent! de! la! presència! de! glucosa! à! Quan! s’acaba! la! glucosa! del! medi,! aquest! enzim! queda! defosforilat! ja! que! cedeix! el! grup! fosfat! a! la! glucosa! per! a! que! aquesta! pugui! entrar!a!la!cèl·lula.!Però!quan!no! hi!ha!glucosa!al! medi,! l’enzim! es! troba! fosforilat! ja! que! no! ha! pogut!cedir!el!seu!grup!fosfat.! L’estat! de! fosforilació! de! l’enzim! implicat! en! la! translocació! de! grup! esta! implicat! en! la! regulació! de! la! glucosa.! Quan! l’enzim! A! II! passa! a! estar! fosforilat! a! A! IIP,! activa! a! l’adenilat! ciclasa! incrementant! els! nivells! de! cAMP.! Aquest! cAMP! ! forma! un! complex! amb! la! proteïna! CRP,!i!aquest!complex!és!el!que!activa!l’operó!Lac.! ! Un!altre!exemple!de!regulació!per!fosforilació!és!el! cas! de! la! isocitrat% deshidrogenasa,! que! és! la! responsable! de! que! l’isocitrat! es! transformi! en! alpha! cetoglutarat.! L’isocitrat! també! es! substrat! de! l’isocitrat! liasa! que! és! l’enzim! responsable! del! cicle!del!glioxilat,!!aquest!cicle!es!com!un!bypas!del! cicle!de!Krebs!(cicle!de!reaccions! anapleròtiques).! Quan!hi!ha!acetat!en!el!medi!la!IDH!disminueix!la! seva!activitat!en!un!75%!perquè!no!es!poden!dur!a! terme! les! descarboxilacions! pròpies! del! CK,! per! tant!aquest!passa!a!ser!substrat!de!l’isocitrat!liasa.!! Com! es! regula! l’! activitat! de! la! IDH?! Mitjançant! fosforilació.! Es! fa! a! través! d’un! enzim! que! presenta!activitat!cinasa!i!fosfatasa,!que!fosforila!i! desfosforila!la!IDH!(IDH!quinasa-fosfatasa! –Ace%K).! Quan!es!troba!desfosforilada!l’enzim!és!actiu.!L’activitat!d’aquest!enzim!serà!la!que!ens!donarà! la!proporció!de!isocitrat!que!anirà!cap!una!ruta!o!altre.!Si!hi!ha!glucosa!els!nivells!de!glicerol!3P,! s’incrementen! i! per! tant! augmenta! l’activitat! desfosforilasa.! Si! els! nivells! disminueixen! perquè! la! bactèria! no! està! creixent! en! glucosa! el! que! es! potencia! és! l’activitat! cinasa,! que! inhibeix!el!cicle!de!Krebs!i!indueix!el!cicle!del!glioxilat.!! !

Metilació:!l’exemple!de!metilació!clàssic!és!el!de!les!proteïnes!que!estan!a!la!membrana!MCP,! que! es! diuen! proteïnes! de! quimiotaxis!que! accepten! metils.! És! un! procés! molt! complex! que! implica!una!cascada!de!regulació!important.!El!reguló!del!flagel!i!la!quimiotaxi!inclouen!50!gens! en! 17! operons,! les! quals! es! transcriuen! en! 3! etapes.! La! bactèria! es! mou! responent! a! la! presència! de! nutrients,! o! repel·lents.! El! moviment! no! és! direccional,! va! combinant! carreres! curtes!i!girs!del!flagel!per!tal!de!canviar!l’orientació!del!moviment!i!respondre!als!estímuls!del! medi.!La!bactèria!té!capacitat!de!detectar!l’estímul!per!quimiotaxi.!! ! Mecanisme! • Si!no!hi!ha!atractant! Els!quimioreceptors!dimèrics!transmembrana! formen!un!complex! amb!els!polipèptids!CheA!i! CheW! i! estimulen! l’activitat! autoquinasa! de! CheA! fins! que! es! fosforila! a! Che! A-P.! Aquesta! transfereix!el!seu!fosfat!a!CheY!que!interactuarà!amb!FliM!en!l’interruptor!del!motor!per!induir! la!rotació!flagel·lar!en!sentit!de!les!agulles!del!rellotge,!per!tal!de!que!es!produeixin!els!girs.! La!desaparició!de!CheY-P!està!promoguda!per!CheZ.! CheB! és! una! metilesterasa! constitutiva! que! s’activa! a! través! de! la! transferència! d’un! grup! fosfat!per!part!de!CheA-P.!CheR!és!una!metiltransferasa!que!metila!certs!residus!de!glutamat! en! els! dominis! citoplasmàtics! dels! receptors.! CheB-P! elimina! els! grups! metil! dels! receptors.! CheZ!manté!l’equilibri!entre!la!forma!fosforilada!i!desfosforilada!de!CheY.! ! • Si!hi!ha!atractant! Quan!l’atractant!s’uneix!directament,!o!en!forma!de!complex!juntament!amb!proteïnes!d’unió! del! substrat,! als! dominis! periplasmàtics! dels! receptors,! aquests! pateixen! un! canvi! conformacional! que! suprimeix! l’activitat! CheA.! Els! nivells! de! CheY! cauen! i! el! flagel! rota! en! sentit! contrari! a! les! agulles! del! rellotge,! fent! que! les! cèl·lules! girin! menys! vegades! i! facin! carreres!més!llargues.!L’activitat!reduïda!de!CheA!fa!disminuir!el!nivell!de!CheB-P.! ! El!moviment!del!flagel!està!connectat!a!una!cascada!de!!fosforilacions.!A!més!hi!ha!proteïnes! acceptores! de! grups! metil.! En! funció! de! si! estan! o! no! metilades! modifiquen! la! seva! funció.! Transdueixen!el!senyal!de!la!membrana!fins!el!cos!basal!per!tal!de!provocar!un!o!altre!tipus!de! gir.!De! manera! que! això! és! en! definitiva!el! que! mou! la!bactèria.! La!bactèria! també! regula!el! temps!d’aquests!períodes,!això!és!el!que!està!regulat!per!metilació.!! ! El! sistema! de! recepció! de! senyal! es! situen! a! la! membrana.! Es! produeix! una! cascada! de! fosforilacions! que!tradueixen!la!senyal!fins!la!base!del!flagel!per!provocar!un!o!altre!tipus!de! gir.! Les!proteïnes!implicades!són!moltes:! Che!A!que!es!pot!autoforforialr!a!CheAP!i!fa!servir!el!fosfat!!per!fosforilar!la!Che!Y!que!actua!en! el!flagel!i!determinarà!el!seu!moviment! à! quan!està!fosforilada! gira!en!direcció!a!les!agulles! del! rellotge! produint-se! girs,! i! si! no! ho! està! produeix! carreres.! En! condicions! atraients! es! produeix!un!equilibri.!Quan!hi!ha!atraient!queda!inhibida!la!fosforilació!de!CheA!i!per!tant!no! es!provoquen!girs,!d’aquesta!manera!es!dirigeix!el!moviment.! S’ha!d’adaptar!la!intensitat!de!l’atraient!per!modulacions!moleculars!àmetilacions:! CheR!à!+CH3-MCP! CheB-P!à!CH3!à!CheA!

! ! Sistema! acetilació! de! citrat! liasa.! Enzim! que! desdobla! el! citrat! en! acetat! i! oxalacetat,! quan! s’utilitza!el!citrat!com!a!font!de!carboni;!invers!de!la!citrat!cintasa.!Si!això!no!està!regulat,!es! produeix!un!cicle!fútil!à!els!producte!d’una!reacció!són!el!substrat!de!l’altre!i!el!resultat!net! serà! 0.! La! citrat! liasa! està! regulada! per! acetilació,!de! manera! que! quan! està! acetilada! és! un! enzim! actiu,! i! quan! no! ho! està! es! troba! inactiu.! Ve! regulada! pels! nivells! de! glutamat.! Si! el! glutamat! és! elevat! (de! citrat! també),! s’inhibeix! la! desacetilació! de! la! liasa! i! ! afavorir! la! seva! acetilació!i!s’activen!i!augmenten! els!nivells!de!liasa.!Si!els!nivells!de! citrat!són!baixos,!els!de! glutamat!també!ho!seran,!es!produeix!una!inactivació!de!la!citrat!liasa!i!haurà!un!increment!de! l’activitat!de!la!sintasa!que!permetrà!sintetitzar!citrat.! El!sistema!de!E.coli!funciona!similar!però!respon!a!nivells!de!transcripció!de!la!liasa.! ! ! ! ! ! ! !

!...