Samenvatting Celcultuur PDF

Preview

Summary

Download Samenvatting Celcultuur PDF

Description

Samenvatting celcultuur 1. Inleiding Geschiedenis Echte doorbraak celculturen rond 1950 door drie belangrijke ontdekkingen: 1) antibiotica: besmetting voorkomen 2) trypsine: cellen losmaken van cultuurflessen, 3) chemisch gedefinieerde cultuurmedia Vanaf 1960 exponentiële toename in publicaties over celculturen Trypsine = een eiwit afbrekende enzym  het splitst alleen peptiden waarvan de carboxylgroep afkomstig is van de basische AZ lysine en arginine en wordt daarom i/h laboratorium toegepast bij structureel onderzoek van eiwitten Types van culturen Weefselcultuur (tissue culture) als algemene term. Vier methoden om tot weefselcultuur te komen 1) Orgaancultuur • 3D-cultuur van niet-gedesagregeerd gedifferentieerd weefsel: histol. Structuur blijft bewaard  niet losgemaakt: stukje orgaan 100 (veiligheidsmarge) Ook: nevenwerkingen, mutageen, carcinogeen? Pas dan: klinische fase: testen op gezonde mensen. Kor samengevat: Vitro 1. Activiteit van de stof bepalen (antiviraal)  IC5O (50% virus wordt geinhibeerd) 2. Cytotoxiciteit  CC50 SI (hoe groter SI hoe beter) wordt ook bepaald

Vivo (dier) 1. Activiteit bepalen: ADME  Absorptie  Distributie  Metabolisme  Excreties 2. Toxiciteit: acute en chronische

Mens 1. Gezonde mensen 2 en 3. Activiteit  FDA en EMA 4. postmarketing

Pagina 3 van 50

3. Neveneffecten, mutageen, carcinogeen?

3) Oncologie: HELA-cellijn (Henrietta Lacks): continue cellijn voor onderzoek naar moleculaire basis van kanker en kankertherapie 4) Hybrydoma technologie: mogelijkheid om cellen continu monoklonale AL te laten produceren. Ontstaan van hybrydoma = cel, ontstaan door fusie van B-cel met kankercel (myeloma). Bcel produceert AL en myeloma is onsterfelijk. Monoklonale AL worden gebruikt in bloedtypering, zwangerschapstesten, virusdetectie,… Ook in onderzoek naar behandeling van kankers. 5) Tissue engineering: doel= vervangen van slecht werkend weefsel door soort bio-implantaat. Ook implantatie van weefsels waarvan cellen aangepast zijn zodat ze kunnen dienen voor afgifte van stoffen zoals insuline die patiënt zelf niet meer maakt (recombinante eiwitten). Ook: skin grafting (huidtransplantatie) en reconstructieve chirurgie (toekomst) 6) Aanmaak van menselijk eiwitten Dierlijke cel zoals fibroblast

snel simpel

Gist (eukaryoot) - saccharomyces cerevisae (bakkersgist) - candida albicans (pathogene gist) Snel Simpel

hoog niet correct niet ja

gemiddeld variabel Beetje Nee

laag correct ja nee

Escherichia coli (prokaryoot) Groeisnelheid complexiteit groeimedium eiwit expressie eiwit opvouwing Glycosylatie verwijdering endotoxinen nodig?

traag (24u) complex

Endotoxinen= Lipide A = bestanddeel van lipide dubbellaag van celmembraan van Gramnegatieve bacteriën. Vormt samen met polysacharide een lipopolysachariden. Bij afbraak van de bacterie komt Lipid A vrij en kan door bloeddrukdaling tot shock leiden. Gevolg is orgaanfalen (want: te weinig bloed). Wanneer parenteralia (geneesmiddel via bloed zoals baxter) gegeven worden, mogen er geen endotoxines in voorkomen)  De maximale expressie systeem, is diegene die de maximale hoeveelheid correct gevouwen bioactieve eiwitten oplevert

2. Karakteristieken van celculturen Bij starten van celcultuur kunnen cellen afkomstig zijn van 1) dierlijk weefsel of 2) celcultuurcollectie. Keuze hangt af van doel van studie en expertise van de onderzoekers  dierlijk weefsel: meer de in vivo situatie benaderen  celcultuurcollectie: goede karakterisatie van groei- en genetische eigenschappen

Pagina 4 van 50

Weefsel  gedissocieerde cellen Primaire cultuur cellen direct uit een orangisme  daarna subcultivatie/passage cellen met dezelfde eigenschappen  zelfde groeisnelheid cellijn:

1) single cell isolatie  Clonale cellijn 2) immortalisatie  Continue cellijn 3) senescentie  Normale cellijn contactinhibitie

Grafiek evolutie cellijn:

Primaire cultuur = cellen worden geïsoleerd uit dierlijk (vaak embryonaal) weefsel en in groeimedium gebracht. 1 celtype wordt geselecteerd door mechanische (in stukjes knippen) en enzymatische (trypsine en collagenase: proteolytische enzymen) technieken. valkuilen:

- selectie van het celtype: snelgroeiende worden geselecteerd - te lange werking trypsine (prolytische enzym) waardoor celbeschadiging - besmetting v/d primaire cultuur

Dierlijk weefsel: geleidelijk senescentie en verlies differentiatie van cellen, daarom subcultivatie nodig. Na de eerste passage is er sprake van secundaire cultuur??. Voorwaarden cellijn (=celpopulaties die continue groeien over verschillende generaties)

Pagina 5 van 50

:

1) aantal cellen neemt toe over generaties heen 2) cellen hebben gelijkaardige groeisnelheid 3) uniforme populatie

Celtypes: dierlijke cellen worden gedefinieerd naar weefsel waaruit ze geïsoleerd werden, zoals: fibroblast, spiercel, epitheelcel,… Selectie van een celtype Primaire cultuur bestaat meestal uit meerdere celtypes. Om een cellijn te vormen moet er 1 celtype geselecteerd worden:   

snelgroeiende cellen overheersen en overgroeien andere cellen samenstelling van het groeimedium beheersen  groeimedium aanpassen door toevoegen van groeifactoren en groei-inhibitoren  bepaalde celtypes zullen dan overheersen. gradiënt centrifugatie met Percoll: cellen worden gescheiden op basis van dichtheid. Gemerkt met marker-deeltjes. na centrifugatie verspreiden deeltjes zich volgens dichtheid. -Veel gebruikt bij bloedonderzoek (scheiding van lymfocyten bv.) zonder Percoll, cellen blijven op de bodem (te zwaar)

Celsuspensie  in suspensie  Anchorage independent  bv. hemopoïetische cellen (bloedcellen)  continue cellijnen (tumoraal) en clonaal roeren! Confluente monolaag=  

Monolayer  Vasthechting aan substraat  anchorage-dependent  normale en continue cellijnen  voordeel: makkelijk kwantificatie  nadelen: geen 3D, geen in vivo situatie

oppervlakte volledig bezet met cellen monolaag  cellen stoppen met groeien

Normale cellen     

Diploïd aantal chromosomen (2n)= dubbel set chromosomen anchorage dependent: substraat-afhankelijk, behalve hemopoïetische cellen. Er is substraat nodig opdat cellen kunnen aanhechten en groeien. groeien tot confluente monoloog van cellen op subsraat beperkte levensduur niet-kwaadaardig

Normale  Substraatafhankelijk  enkel monolaag (uitz: bloedcellen  Contactinhibitie  na monolaag: afsterven van de cellen Oplossing: nadat de monolaag gevromd is: cellen in andere fles brengen (=passage)  Rijk medium nodig

Continue  



Monolaag Substr.onfh suspensie Kunnen na cel-cel contact blijven groeien (bv. Tumoren)  overgroei Geen rijk medium nodig

Voordeel monolaag: je kunt de cellen tijdens de groei met de microscoop bekijken Nadeel monolaag: geen 3D, bijgevolg geen in vivo situatie Celadhesie

Pagina 6 van 50

Na subcultivatie hechten normale zich vast aan substraat, voordat ze delen. Substraat is ofwel (negatief geladen) glas of plastic (polystyreen). Celadhesie wordt gemedieerd door specifieke celoppervlakte-receptoren voor matrix moleculen van ECM (=extracellulaire matrix). Cellen produceren ECM-eiwitten en proteoglycanen, voordat ze gaan binden met het substraat. ECM hecht aan substraat, zodat cellen via receptoren met ECM binden.

ECM eiwitten en protepglycanen

Deze gaat hier aan Cel met receptoren voor ECM 

Nooit rechtstreeks verbonden met b t t

Hydrofiel/negatief geladen substraat. Hydrofiel oppervlak want eiwitrofielten en proteoglycanen (adhesiemoleculen zijn hy

Goed substraat: - waar vroeger celgroei plaatsvond  beter substraat voor celadhesie  De ECM eiwitten en proteoglycanen blijven vastgehecht aan substraat. - voorbehandeld met matrix-bestanddelen zoals collageen en fibronectine  faciliteert adhesie: cellen gaan sneller hechten  moeten geen ECM eiwitten en proteoglycanen aanmaken Cel-cel en cel-substraat adhesie: Rol van 3 transmembranaire eiwitten (zie figuur) 1) CAM: Ca2+-onafhankelijke celadhesiemoleculen: interacties tussen homologe cellen. Selfinteractive: homologe moleculen in tegenoverliggende cellen interageren met elkaar. Ook cadherinen: wel Ca2+-afhankelijk, negatief geladen. Tekening:

2) integrines: reguleren cel-substraatinteracties  interacties met collageen via RGD: Receptoren op cellen interageren met fibronectine en collageen van matrix via RGD= specifiek motief op matrixmoleculen: arginine, glycine of asparaginezuur. Tekening:

3) transmebranaire proteoglycanen (lagere affiniteit): interactie met collageen, met matrixmoleculen zoals collageen en proteoglycaan, maar niet via RGD Bij desegregatie door proteasen. Trypsine) binding gaat kapot  cellen komen los van elkaar en van het substraat: hoe?  binding tussen CAM’s en cadherinen wordt afgebroken, de ECM wordt ook afgebroken. Bij te veel trypsine gaan naast deze eiwitten en proteoglycanen, ook de cellen kapot. . Epitheelcellen zijn (i.t.t. mesenchymcellen) beter bestand tegen desegregatie door talrijke juncties. Cel moet in elk geval terug matrixmoleculen produceren vooral kan binden met substraat. Kweek van gedifferentieerde cellen Differentiatie= proces waarbij cellen geleidelijk van karakteristieken veranderen zodat ze zich ontwikkelen tot gespecialiseerde cellen (slechte groeiers in cultuur), zoals neuronen, spiercellen.

Pagina 7 van 50

Gebeurt embryonaal of bij wondheling. Ongedifferentieerde precursoren= stamcellen.  differentiatie ook geassocieerd met vervanging van normale cellen, zoals in het bloed. Stamcellen, tumor- en embryonale cellen (=ongedifferentieerd: stamcellen, tumorale cellen, embryonale cellen )  groeien goed in cultuur. Wanneer ze differentiëren, verliezen ze goede groeicapaciteiten. Maar Wanneer cellen afkomstig van weefsel, geplaatst worden in cultuur, kunnen ze hun gedifferentieerde eigenschappen verliezen. Waarom? : - selectieve uitgroei: ongedifferentieerde celtypes overheersen: fibroblasten en epitheelcellen afkomstig van niet-groeiend dierlijk weefsel - aanpassing van cellen aan cultuurmedium Tumorcellen zijn ongedifferentieerd en kunnen goed groeien. Uitzondering is neuroblastoma: gedifferentieerd en kan toch snel groeien. Examenvraag: Methoden om gedifferentieerde cellen zo goed mogelijk te kunnen laten groeien  medium toevoegen die cellen niet nodig heeft: 1.

hormonen en groeifactoren: om gedifferentieerde toestand van celtype (zoals hepatocyt, keratinocyt, …) te behouden. 2. chemische verbindingen: DMSO: dimethyl sulfoxide: draagt bij aan het behoud van de gedifferentieerde toestand door een membraan fluïditeit effect  lost ook stoffen op, = vetoplosbaar, belangrijk om toxiciteit te bepalen

3. cel interacties: contact tussen de cellen laat de vorming van gap junctions toe zodat metabolieten de expressie van differentiatie binnen een celpopulatie kan synchroniseren  daarom is het voordelig om te werken histotypische of organotypische culturen  in vivo situatie nabootsen 4. interactie met het groei-oppervlak: door collageen op het groei-oppervlak te zetten, behoudt de cel haar polariteit (hepatocyten). Celpolariteit wordt in stand gehouden door asymmetrische verdeling van ionenstromen (vnl. Ca2+) en laat toe om de 2 uiteinden van een cel een andere functie te vervullen. Tekening:

5. Om de in vivo situatie na te bootsen is ook [O2] belangrijk 6. Zie slide kweek van gedifferentieerde cellen (3) Getransformeerde cellen= tumorale cellen In deze context betekent transformatie: omzetting van dierlijke cellen met normale groeicapaciteit naar cellen met onbeperkte groeicapaciteit. Hoeft niet kwaadaardig te zijn. Eigenschappen:

- anchorage independent: substraat-onafhankelijk ofwel in halfvaste media (agar) - aneuploïdie

Cel transformeren door behandeling met mutageen, virus of oncogeen1  retrovirus: brengt geactiveerd oncogeen tot expressie, die transformatie veroorzaakt 1 oncogeen= gen dat vorming tumorale cel induceert. Pagina 8 van 50

 controleerbare transformatie: temperatuurgevoelige mutant van immortaliserend gen  metallothioneïne promotor: kan pas geactiveerd worden met zwaar metaalion.  mutageen zoals dioxines, ethidiumbromide

Celbanken Verkopen van goed gekarakteriseerde cellijnen als diepgevroren stalen (107cellen/ml). Bij aankomst moet ontdooit, geïnoculeerd of bewaard worden in vloeibare stikstof ATCC: American Type Culture Collection ECACC: European Collection of Animal Cell Culture Cellijnen: cellijn CHO

afkomst chinese hamster ovary

celtype epitheliaal

HeLa

epitheliaal

MDCK

human cervical carcinoma (baarmoederhalskanker) Madin Darby canine kidney

epitheliaal

MRC-5

Human embryonic lung

fibroblast

L6

Rat skeletal muscle

myoblast

Niet kennen substraat en suspensie, genetic engineering snel groeiende kankercellijn substraat-afhankelijk, veterinaire vaccin productie beperkte levensduur, humaan vaccin productie Kan gebruikt worden voor differentiatie van een spiercel

Evolutie van cellijnen: zie figuur

3. Materialen Substraat De meeste dierlijke cellen groeien in monolaag op substraat, dewelke geladen moet zijn om celadhesie toe te laten anchorage dependence Glas: Voordelen:   

Goedkoop en makkelijk te steriliseren met droge/natte hitte Heeft goede optische eigenschappen  transparant Goed substraat voor cellen  Correcte negatieve lading voor aanhechting. Deze gaat wel verloren bij sterke basen (NaOH).

Nadelen  

Arbeidsintensief  45000 Euro per laborant/jaar Weinigzekerheid  chemische en microbiologische contaminatie

Hierdoor overspa naar plastiek

Pagina 9 van 50

Plastiek (voorgesteriliseerd): polystyreen is goedkoop en goede optische eigenschappen, maar hydrofoob! Daarom behandeling met glasplasma of γ-stralen om negatieve lading te verkrijgen (OH opzetten) Hydrofiel. Ook deze substraten zijn mogelijk: 7. PVC: polyvinylchloride 8. polycarbonaat 9. PTFE: polytetrafluorethyleen Polystyreen 10. Transparant 11. weinig resistent tegen DMSO (chemicaliën) 12. minder resistent tegen hitte  geen 100°C  in kweekflessen

Polypropileen 13. melkachtig (minder doorzichtig) 14. resistent tegen DMSO 15. wel resistent tegen hitte 100°C  stockoplossing proefbuizen

Keuze recipiënt  geen examenstof is afhankelijk van: 1) Celopbrengst: “cell yield” in monolaag-culturen is celopbrengst evenredig met beschikbare oppervlakte a. multiwell: kleine volumes b. petriplaten: aangeduid volgens diameter c. flessen: T10=10cm² beschikbare oppervlakte in celsuspensie: alle drie mogelijk, ook roerfles ‘stirrer bottle’, maar roersnelheid mag niet te hoog zijn, ongeveer 60 toeren per minuut.

Celopbrengst verhogen Anchorage dependent Anchorage independent Spinner (met draaiknop en roerstaaf) en Roller bottle (steeds laten rollen, zodat aan shaker flasks (schudden) heel fles celadhesie), CellSTACK cultuurkamers, E-Cube system (telkens vers medium) Belang kwaliteitscontrole!

1) Wie mag binnen 2) SOP: standard operating procedure: vaste regels en handelingen

2) Beluchting multiwells en petriplaten hebben loszittend deksel dat gasuitwisseling toelaat. CO2 kan naar binnen maar bacterie kan niet naar boven lopen. Bij flessen is beluchting mogelijk door stop 1 slag los te draaien. De porie moet daarbij < 1-3 μm (=grootte micro-organisme) Ook mogelijk is flessen kopen met permeabele filter in stop. Deze verhinderen besmetting van de cultuur door kiemen van de incubator. 3) Analyse en staalname multiwells ideaal om op dezelfde moment dezelfde bewerkingen te doen bij cellen.  polystyreen kan oplossen bij staalname met organische solventen (aceton, tolueen), we kunnen dit verhinderen met TPX (thermanox cover slip) dekglaasjes op bodem van well en cellen daarop te laten groeien. glas is aangewezen bij DNA extractie door middel van warm perchloorzuur Pagina 10 van 50

4) Prijs petrischalen goedkoper en makkelijker dan flessen maar gevoeliger voor besmetting en uitdrogen van cellen. Glas kost veel aan manuren voor hergebruik en dan is men nog niet zeker i.v.m. eventuele contaminatie.

Gespecialiseerde systemen 1) Permeabele systemen 1) Filter Wells WAT: Dit zijn inzetelementen van meestal polystyreen en een membraan waaraan cellen hechten. De poriën van het (permeabele) membraan laten uitwisseling tussen buitenste (well) compartiment en binnenste (het inzet-element) compartiment toe. De filter well hangt in de well maar komt nooit in contact met bodem van de well. Kunnen eventueel voorbehandeld worden met laminine/collageen. Doel is celgroei te verhogen in een in vivo benadering. Worden gebruikt in studies naar: - cel-cel interacties - cel-matrixinteracties - differentiatie - transepitheliale permeabiliteit voorbeeld: Millipore (firma) maakt Millicel CM. Membraan is gemaakt van nitrocellulose en heeft porositeit van 0.45μm. TEKENING

VOORDELEN: - 3D: benadering in vivo - hogere celdensiteit - betere differentiatie aan zowel boven-als onderkant groeien cellen NADELEN?: TOEPASSING: - elektrofysiologie - SEM/TEM (elektronenmicroscopie) - transportfuncties: Transportfunctie bestuderen: RA (=radioactief stof (bv. Fluor) kan enkel in de onderste laag geraken als RA door de cellen gaat! vb glucosetransport  kan glucose door filter? Als na experiment evenhoge concentratie boven als onderfilterwell  ja, kan erdoor  bij geneesmiddel: oraal ingenomen: moet door darmcellen (enterocyten) heen kunnen  meten met behulp van filter well: - geneesmiddel radio-actief merken - fluoprobe (kleuring) - reactie uitlokken Pagina 11 van 50

metabolisme nagaan 2) Hollow fibers (examenvraag: vergelijk met filter wells) WAT: Dit is een perfusiekamer met permeabele plastieken microcapillairen, die gas-en voedingsstofpermeabel zijn en cellen kunnen aan buitenzijde groeien. Het medium is 5% CO2-verzadigd en wordt rondgepompt in microcapillairen (intracappilaire ruimte). Cellen worden toegevoegd aan buitenste kamer die microcapillairen omgeven (extracapillaire ruimte). Cellen hechten zich aan buitenkant microcapillairen en ontvangen voedingsstoffen via continue perfusie van capillairen met medium. Gesecreteerde moleculen worden verzameld. Afvalstoffen dringen door de vezels en worden zo met het groeimedium meegesleept. Kleine moleculen zoals glucose en afvalstoffen kunnen en door de vezelwanden, terwijl grote moleculen zoals eiwitten, antilichamen en virussen hierdoor niet kunnen. Omdat de gesectreteerde producten (bv. Insuline) niet door de vezels kunnen, worden ze apart verzameld. VOORDELEN  hoge celdensiteit  verschillende plastiek- en ultrafiltratieeigenschappen geven met cut-off points van 10, 50 of 100 kDa en reguleren diffusie van macromoleculen. Zo worden hoge concentraties van hoog-moleculaire producten bekomen. NADELEN TEKENING (zie schets achterkant pagina 2)

TOEPASSING: aanmaak grote moleculen kunnen dienen als geneesmiddel 2) Voorbehandelde oppervlakten

1)

Matrix coating ECM nodig voor celadhesie, met als doel: bevordering aanhechting, groei en differentiatie voorbehandeling van het substraat (voorbeelden  een voorbeeld kunnen geven): a. Medium van een andere celcultuur (spent medium) b. poly-D-lysine  bevordert adhesie en groei van vb. primaire neuronen c. Gelatine  aanhechting spier-en endotheelcellen d. Collageen  aanhechting epitheelcellen Pagina 12 van 50

e. Chondronectine  aanhechting chondrocyten 2) Feeder lagen Sommige cellen hebben nood aan andere levende cellen. Vooral bij lage celdensiteiten. Feedercellen (onderste cellen) gaan groeifactoren (ook onbekende factoren). Groeifactoren geproduceerd door 1e laag (federcellen) worden doorgegeven aan 2e....